ДНК в криминалистике

Часть 2. Методы типирования ДНК.

Зная о генетической исключительности каждого человека, криминалисты давно мечтали о возможности использования этого свойства в целях идентификации личности. Однако практическое осуществление их мечты стало возможным лишь с 1985 года. Каким же образом проистекает процесс идентификации, если два человека генетически различаются между собой в среднем всего лишь на 0,01%?

Действительно, установить столь малые различия было бы довольно сложно, если бы они были распределены равномерно по всему геному. К счастью, задача криминалистов значительно облегчается тем, что различия, о которых идет речь, локализованы в определенных регионах (локусах) хромосом. Такие локусы получили название гипервариабельных участков. Они, как правило, расположены в зонах негенной (некодирующей, или junk) ДНК, а, следовательно, не являются генами, т.е. не кодируют белки или РНК.

Алек Джеффрис

Анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (RFLP), впервые описанный Алеком Джеффрисом, создал предпосылку для идентификации личности на основании индивидуальных генетических различий. Этот метод является интегральным и выявляет изменения как в числе и расположении специфических участков для распознавания рестриктазами (т. наз. сайтов рестрикции), так и изменения (удлинение или укорочение) самих гипервариабельных участков.

Появление новых или исчезновение существующих сайтов рестрикции происходит вследствие мутаций: замен отдельных нуклеотидов, а также инверсий ("перевертываний"), делеций (потерь) и инсерций (вставок) участков ДНК. Изменения же длины гипервариабельных участков обусловлено более сложными реорганизациями генома: транспозициями, неравными рекомбинациями и "проскальзыванием" ДНК-полимеразного комплекса.

В результате подобных редких "сбоев" ДНК различных людей режется рестриктазами на разные неравные "куски" (как показано на рисунке ниже).

Принцип метода RFLP.

Схематично RFLP-анализ можно представить следующим образом: после обработки ферментами рестрикции различные образцы ДНК помещают на разные дорожки в гель и подвергают воздействию электрического поля (процесс носит название гель-электрофореза). Электрическое поле заставляет их двигаться по своим дорожкам, причем более мелкие фрагменты движутся быстрее, чем крупные. Далее фрагменты переносятся на нитроцеллюлозную мембрану (процесс блоттинга), с которой они прочно связываются. Мембрана помещается в раствор, содержащий радиоактивную ДНК-пробу, где происходит гибридизация пробы с уникальными последовательностями гипервариабельных участков. Затем мембрану накладывают на рентгеновскую пленку и получают радиоавтограф, на котором радиоактивные элементы выявляются в виде серии полос, число и положение которых различно для каждого индивида.

Помимо радиоактивных, существуют также другие методы детекции, такие как флуоресцентная визуализация, хромогенные иммунохимические реакции и т.д. Однако независимо от того, какой ДНК-зонд был использован, на конечном этапе анализа формируется графический образ: дорожка, поперечно исчерченная чередующимися полосами.

Что же представляют собой гипервариабельные участки ДНК? Как показали исследования Джеффриса, одними из таких регионов являются структуры, известные как VNTR (Variable Number of Tandem Repeats, вариабельное число тандемных повторов) и широко использующихся для целей идентификации по настоящее время.

В каждый VNTR-локус входит от 500 до 10 000 пар нуклеотидов. Особенность VNTR заключается в том, что они целиком состоят из одной-двух ключевых последовательностей нуклеотидов, длиной обычно в 15 - 35 пар оснований, которые непрерывно повторяются большое количество раз (поэтому вся последовательность VNTR и называется тандемной). Именно к таким тандемным последовательностям VNTR и подбирают зонды при детекции по методу RFLP.

Число повторов в данном конкретном VNTR различно для разных людей. В человеческой популяции насчитывают до ста и более известных разновидностей (аллелей) по длине для каждого VNTR. При этом ни одна из них не является особенно распространенной, поэтому возможно огромное число вариаций длин разных VNTR между индивидами, проявляющихся при проведении RFLP.

Данная конкретная последовательность VNTR может быть либо уникальной в геноме (т.е. находиться только в одном локусе), либо "разбросанной" по нескольким участкам ДНК. Соответственно, анализ с использованием зонда к уникальной последовательности (монолокусный анализ) даст в результате одну или две полосы на "ДНК-дорожке". Одна полоса образуется в том случае, если отец и мать исследуемого индивида обладали одной и той же разновидностью данного гипервариабельного участка VNTR. Полилокусный (мультилокусный) же анализ даст более сложную картину из множества чередующихся полос.

Использование анализа VNTR очень удобно и для целей установления отцовства. Для вынесения вердикта рассматриваются те локусы, по которым ребенок является гетерозиготным, то есть когда варианты VNTR, полученные им от отца и от матери, различны. В этом случае положение каждой из дорожек должно совпадать с дорожкой того из родителей, от которого был унаследован соответствующий VNTR.

И все же в некоторых случаях использование VNTR оказывается невозможным. Такие ситуации возникают, например, если имеется недостаточное количество образца для проведения анализа. К тому же, большое число повторов в VNTR, способствующее их большей вариабельности, в некоторых случаях может оказаться их недостатком: чем длиннее фрагмент ДНК, тем больше вероятность того, что он подвергнется деградирующему действию различных повреждающих внешних факторов.

Так, анализ VNTR часто оказывается неприемлемым для идентификации останков по прошествии длительного отрезка времени, а также сильно поврежденных останков (в результате катастроф и т.д.). Поэтому в таких случаях принято исследовать фрагменты другого типа - STR (Short Tandem Repeats, короткие тандемные повторы). Как и VNTR, STR состоят из тандемных повторов длиной в несколько нуклеотидов (обычно от 3 до 5 пар оснований), только число таких повторов меньше, и, следовательно, имеется меньше разновидностей каждого локуса (от 7 до 15 на локус). Но именно благодаря небольшим размерам удобно их исследование посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Рассказ об этой методике - в следующей части заметок.

Ольга Лютаревич
Scientific.ru