|
Йочева Л.Д., Антонова-Николова С.К. Биологический факультет Софийского университета им. Св. Кл. Охридского, Болгария
В начало...
Процессы получения и регенерации протопластов способствуют возрастанию изменчивости по признаку антибиотикообразования у штамма Streptomyces galbus (F) subsp. achromogenes 695 и его активных вариантов 695-3-2 и 695-3-2-206. Среди ревертантов штамма 695 отобран вариант 695-Р24, превышающий по активности исходный штамм в 2 раза. Среди всех анализируемых ревертантов не обнаружено вариантов, утративших способность к биосинтезу основных компонентов антибиотика А-695, но протопластирование штаммов 695-3-2-206 и 695-Р24 приводит к появлению вариантов, синтезирующих новые компоненты актиномицинового комплекса.Ключевые слова:
Известно, что получение и регенерация протопластов стрептомицетов являются эффективными методами воздействия на геном стрептомицетов - продуцентов антибиотиков и получения штаммов, обладающих более высоким уровнем антибиотикообразования [1-6].
Цель настоящей работы - изучение влияния протопластирования на антибиотическую активность и образование вариантов штаммов Streptomyces galbus (F) subsp. achromogenes 695, 695-3-2 и 695-3-2-206 с измененным составом антибиотического комплекса.
В работе использовали штамм S.galbus (F) subsp. achromogenes 695 [7], продуцент противоопухолевого антибиотика А-695, и его высокоактивные варианты: штамм 695-2-3, полученный после воздействия УФ-лучами, и штамм 695-2-3-206, полученный после последующего воздействия нитрозогуанидином.
А-695 - актиномициновый комплекс, содержащий 3 биологически активных компонента, которые условно обозначены как АМ1, АМ2 и АМ3. Главным компонентом антибиотика является АМ2 (58,6%), идентифицированный как актиномицин D. Количество остальных компонентов АМ1 и АМ3 составляет соответственно 31,2% и 10,2%. Актиномициновые комплексы, синтезированные штаммом 695-3-2-206 и штаммом 695-3-2, содержат те же самые компоненты, но в других соотношениях [8].
Обработку мицелия и регенерацию протопластов проводили по методике Оkanishi et al. [9] с небольшими модификациями. Для регенерации протопластов использовали среду R2YЕ [10].
Штаммы и их ревертанты выращивали на среде, содержащей (в г/л): декстрин - 20; КNO3 - 3,5; К2НРO4 - 0,52; МgSO4?7Н2O - 0,025; FеSO4?7Н2O - 0,025; ZnSO4?7Н2O - 0,025; СаСl2?2Н2O - 0,025. Ферментацию вели на качалке (220 об/мин) при 28 ?С в течение 7 сут. Антибиотическую активность определяли биологическим методом диффузии в агар с тест-культурой УФ2 (мутант Staphylococcus aureus 209).
Концентрацию антибиотика в бутанольных экстрактах культуральной жидкости штаммов и их ревертантов определяли спектрофотометрически, а его состав - методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах "Merck Kieselgel 60" в системе растворителей этилацетат - метанол - вода (20:4:20). Концентрации компонентов А-695 определяли по методу Rachev et al. [11] с последующей денситометрией на спектрометре "Shimadzu CS 930" при длине волны 441 нм. В качестве контроля использовали стандартные растворы актиномицина D.
После протопластирования и регенерации культур штамма S.galbus (F) subsp. achromogenes 695 и его вариантов 695-3-2 и 695-3-2-206 были отобраны и проверены на способность к биосинтезу антибиотика A-695 соответственно 106, 100 и 162 варианта. Полученные данные, подвергнутые статистической обработке, представлены на рис. 1-3. Антибиотическая активность дикого штамма 695 была в пределах 60-120% от активности популяции. Протопластирование приводило к возникновению вариантов, активность которых колебалась от 20 до 140% по сравнению с исходным штаммом. Число вариантов с пониженным уровнем активности в общей популяции было невелико (8%), появились и варианты (6%) с активностью, составляющей 120-140% по сравнению с контролем (рис. 1). При статистическом анализе распределения значений антибиотической активности у отдельных колоний штамма 695-3-2 и регенерировавших протопластов выявлено, что коэффициент вариации возрос с 8,5% до 33,2%. Увеличение коэффициента вариации происходит за счет появления как неактивных, так и более активных по сравнению с исходным штаммом вариантов (рис. 2). Естественная изменчивость штамма 695-3-2-206 по признаку антибиотикообразования была относительно высокой (40-120%). После протопластирования изменение антибиотической активности произошло за счет уменьшения количества низкопродуктивных вариантов и появления вариантов с активностью, составляющей 120-140% по сравнению с контролем (рис. 3).
 |
Рис. 1. Распределение значений антибиотической активности штамма S.galbus (F) subsp. achromogenes 695 (a) и его регенерировавших протопластов (б).
Здесь и на рис. 2 и 3: по оси абсцисс - активность по отношению к средней для исходной культуры (в %); по оси ординат - количество вариантов (в %). |
 |
Рис. 2. Распределение значений антибиотической активности штамма S.galbus (F) subsp. achromogenes 695-3-2 (а) и его регенерировавших протопластов (б). |
 |
Рис. 3. Распределение значений антибиотической активности штамма S.galbus (F) subsp. achromogenes 695-3-2-206 (а) и его регенерировавших протопластов (б). |
Методами спектрофотометрии и ТСХ обнаружено, что в популяции регенерировавших протопластов штамма 695 присутствуют в основном варианты с измененным соотношением компонентов А-695: содержание АМ1 увеличено (до 68%) за счет уменьшения количества АМ2 (табл. 1). Получение и регенерация протопластов дикого штамма оказывают на биосинтез разных компонентов А-695 такое же воздействие, как комбинированный эффект УФ-облучения и нитрозогуанидина - соотношение компонентов становилось таким же, как у штамма 695-3-2-206. Среди ревертантов штамма 695 отобран вариант 695-Р24, биосинтетическая активность которого в 2 раза превышает активность исходного штамма. Влияние повторного протопластирования на антибиотическую активность этого варианта было незначительным, но состав антибиотического комплекса изменялся существенно. В актиномициновом комплексе многих ревертантов обнаружен четвертый компонент - АМ1 (Rf 0,35). Его количество в антибиотическом комплексе было относительно высоким - вторым после АМ1 (см. табл. 1).
| Таблица 1. Соотношение компонентов актиномицинового комплекса у вариантов, полученных после протопластирования штамма 695 |
| N варианта |
Kомпоненты, % |
| АМ1 |
АМ2 |
АМ3 |
Новая фракция АМ1 |
| 695 (K) |
31,23 |
58,63 |
10,14 |
|
| Р2 |
68,14 |
28,50 |
3,36 |
| Р6 |
30,54 |
43,78 |
25,68 |
| Р15 |
45,70 |
44,15 |
10,15 |
| Р25 |
55,77 |
23,90 |
20,33 |
| Р40 |
61,22 |
29,66 |
9,12 |
| Р45 |
46,65 |
39,50 |
13,85 |
| Р51 |
64,08 |
30,12 |
5,80 |
| Р24 |
42,46 |
40,06 |
17,48 |
| Р24-Р11 |
40,14 |
21,05 |
16,61 |
22,20 |
| Р24-Р15 |
54,63 |
8,38 |
3,33 |
33,66 |
| Р24-Р17 |
42,10 |
17,13 |
8,85 |
31,92 |
| Р24-Р100 |
52,04 |
16,32 |
9,98 |
21,66 |
| Р24-Р112 |
40,27 |
14,73 |
13,03 |
31,97 |
| Р24-Р114 |
47,77 |
21,98 |
13,29 |
16,96 |
| Р24-Р126 |
42,85 |
17,54 |
11,10 |
28,51 |
| Р24-Р127 |
39,08 |
19,85 |
13,26 |
27,81 |
| Р24-Р128 |
43,13 |
42,48 |
14,39 |
|
| Р24-Р129 |
48,00 |
29,22 |
22,78 |
| Р24-Р135 |
55,21 |
28,55 |
16,24 |
Примечание. Значения Rf для АМ1 - 0,25, АМ2 - 0,41, АМ3 - 0,51 и для фракции АМ1 - 0,35.
Далее...
Написать комментарий
|
