|
Тренин А.С., Толстых И.В., Терехова Л.П., Зенкова В.А., Макарова М.О., Гладких Е.Г., Бычкова О.П., Катруха Г.С., Дудник Ю.В. НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН, Москва
В начало...
Из культуральной жидкости штамма гриба ИНА F-86/88, идентифицированного как Fusarium lateritium Nees vаr. stilboides (Wr.) Bilai, выделен циклодепсипептидный антибиотик 86/88 (энниатин В), обладающий выраженным гиполипидемическим действием. В культуре клеток Нер G2 он подавляет включение 14С-ацетата во фракции холестерина (ИК50 1,75 мкМ), эфиров холестерина (ИК50 1 мкМ), триглицеридов (ИК50 1,3 мкМ) и свободных жирных кислот (ИК50 2,2 мкМ). Наиболее выраженный эффект препарата - подавление синтеза эфиров холестерина - может быть следствием не только ингибирования АХАТ, но также результатом вызываемого антибиотиком подавления синтеза триглицеридов и снижения содержания в клетках свободных жирных кислот.Ключевые слова:
Среди микробных вторичных метаболитов, обладающих гиполипидемическим действием и рассматриваемых в качестве перспективных средств лечения атеросклероза, особое место занимают ингибиторы ацил-КоА: холестеролацилтрансферазы (АХАТ) - одного из ключевых ферментов липидного обмена. Происходящее под воздействием указанного фермента преобразование холестерина (ХС) в эфиры холестерина (ЭХ) необходимо как для активного всасывания ХС, потребляемого с пищей, так и для создания запаса ХС в виде его эфиров в различных органах и тканях, в том числе в атероматозных бляшках. Применение ингибиторов АХАТ может способствовать нормализации атерогенной ситуации в организме, регрессии повреждений сосудистой стенки [1, 2].
Известно, что циклодепсипептидные антибиотики энниатины, образуемые различными видами грибов рода Fusarium, обладают выраженной способностью к подавлению АХАТ [3, 4]. В процессе поиска микробных метаболитов, обладающих гиполипидемическим действием, был отобран штамм гриба ИНА F-86/88, идентифицированный как Fusarium lateritium Nees var. stilboides (Wr.) Bilai [5]. Из его культуральной жидкости выделен антибиотик 86/88, идентификация которого по физико-химическим характеристикам показала, что он относится к классу депсипептидов и является энниатином В.
Целью настоящей работы являлось изучение физико-химических свойств антибиотика 86/88, его биосинтеза и механизма действия.
Объект, таксономия, культивирование, определение биологической активности. Штамм гриба ИНА F-86/88 был выделен из образца почвы Монголии. Для определения таксономического положения культуру выращивали на сусло-агаре и кислом агаре Чапека при температуре 28 ?С в течение 10-15 суток [6]. Таксономическую идентификацию проводили по морфологическим и культуральным признакам по определителю Билай В.И. [5].
Для изучения антибиотической активности культуру гриба выращивали в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих 50-150 мл питательной среды, на качалках при 28 ?С в течение 5-11 суток. Изучение биосинтеза антибиотика проводили в различных по составу жидких питательных средах: картофельно-глюкозной, Чапека, Билай, а также в среде с пептоном. В качестве инокулята использовали 10-суточную культуру, выращенную на кислом агаре Чапека или сусло-агаре. Для получения большого объема культуральной жидкости культивирование проводили в ферментере вместимостью 180 л (коэффициент заполнения 0,6) в течение 5- 11 суток в зависимости от условий аэрации. Инокулятом служила 3-суточная культура, выращенная в среде следующего
состава (в г/л): глюкоза - 40,0; пептон -10,0; NaNО3 - 3,0; КН2РО4 - 2,0; МgSO4?7Н2O - 0,5; КСl - 0,5; FеSO4?7Н2O - 0,01; рН 5,5-5,6. В дальнейшем для биосинтеза антибиотика в ферментере использовали более продуктивные среды, специально разработанные для этой цели на основе монофакторных экспериментов.
Антибиотическую активность культуральной жидкости определяли методом диффузии в агар в отношении различных бактериальных тест-микроорганизмов: Васillus subtilis АТСС 6633, Мicrococcus luteus АТСС 9341, Stарhуlососсus аureus АТСС 21027, Еscherichia соli АТСС 25922, а также в отношении грибов Сапdida аlbicans ИНА 3G, Аspergillus niger ИНА 12G и Fusarium oxysporum ИНА 204G.
Изучение действия микробных метаболитов на синтез холестерина, его эфиров и липидов различных классов проводили с использованием культуры клеток Нер G2 [7]. Клетки Нер G2 культивировали в 75 см2 флаконах в минимальной среде Игла ("Flow"", Великобритания) в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл канамицина, 4 мМ L-глутамина при 37 ?С в СО2-инкубаторе в атмосфере 95% воздуха и 5% СO2. Для постановки экспериментов клетки переносили в 24-луночные планшеты ("Flow", Великобритания) с плотностью 2x105 клеток на лунку и выращивали до достижения ими состояния субконфлуентного монослоя. Непосредственно перед внесением антибиотиков осуществляли кратковременную (1 час) инкубацию в бессывороточной среде. Дальнейшую инкубацию клеток проводили в среде Игла, содержащей 5 мкКи/мл натрия (2-14С)-уксуснокислого (удельная активность 40,6 Ки/моль) в присутствии или в отсутствие тестируемых микробных метаболитов.
Исследуемые препараты вносили в виде спиртовых растворов одновременно с радиоактивным предшественником из расчета 2,5 мкл на 0,5 мл среды. Контрольным препаратом служил ловастатин ("Меrск Sharp and Dohme", США). Продолжительность инкубации составила 3 ч.
Экстракция клеточных липидов, методы их хроматографического разделения на пластинах "Silufol" с последующей оценкой уровня радиоактивности различных липидных фракций аналогичны описанным ранее [8, 9]. Включение 14С-ацетата в липиды разных классов представляли в пересчете на 1 мг клеточного белка, определяемого по Лоури [10]. Цитотоксичность антибиотиков определяли окрашиванием клеток Нер G2 0,5% раствором трипанового синего, а также изучая воздействие препаратов на синтез белка. В последнем случае клетки Нер G2 инкубировали с препаратами антибиотиков в течение 3 ч в присутствии 5 мкКи/мл 14C-лейцина (удельная активность 135 Ки/моль). После отмывания клеток от невключившегося радиоактивного предшественника 0,1 М холодным фосфатным буфером (рН 7,0) их лизировали, добавляя 0,1 н. NаОН. Клеточный белок осаждали 10% ТХУ, дважды промывали и ресуспендировали в фосфатном буфере. Измерение радиоактивности проводили в диоксановом сцинтилляторе ЖС-8.
Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. За 100% принимали уровень включения радиоактивных предшественников в клетках контрольных лунок, содержавших 0,5% этанола.
Выделение и химическая очистка антибиотика. Препарат антибиотика получали из культуральной жидкости продуцента (5 л) сорбцией на aмберлите XАD-2 с последующей элюцией смесью ацетон - бутанол - вода (1:1:1). Элюат, упаренный до маслянистого остатка, растворяли в этаноле (5 мл). Выделенный концентрат антибиотика наносили на колонку с кремниевой кислотой для последующего хроматографического разделения и получения индивидуальных компонентов. Очистку проводили дважды, используя в качестве элюентов системы: гексан - ацетон (4:1) и гексан - метанол (99:1). Получаемые фракции анализировали с помощью ТСХ на пластинах "Silufol" в системах: (А) гексан - ацетон (12:8), (Б) хлороформ - этилацетат (7:3) и (В) хлороформ - метанол (20:3) с последующим проявлением 1% раствором КМnO4. Фракции, содержащие компонент, обладающий после проявления розовым цветом и имеющий в указанных системах соответственно Rf = 0,75; 0,60 и 0,45, объединяли, упаривали досуха, вещество кристаллизовали из этанола или метанола. Выход продукта составлял около 4,5 мг. Аминокислотный состав антибиотика определяли после кислотного гидролиза в вакуумированных ампулах (6 н. НСl, 106?С, 24 ч). После упаривания досуха гидролизат антибиотика анализировали методом электрофореза на бумаге Filtrack FN-16 (Германия) (электролит 2 н. уксусная кислота, 550 В, 2 ч) и хроматографии на бумаге в системе бутанол-1 - уксусная кислота - вода (4:1:1) с последующим проявлением 0,5% нингидрином в ацетоне и п-нитробензоилхлорид-пиридиновым реактивом на N-метиламинокислоты [11]. Адсорбционные (UV-VIS) спектры антибиотика 86/88 получены на спектрофотометре Specord М-40 ("Саrl Zeiss", Jena) в этаноле, с = 0,25 мг/мл; ИК-спектры регистрировали в таблетках КВr на приборе SР-1100 ("Руе Unicam", Великобритания). Масс-спектры сняты на приборе МS-50С ("Кratos", Великобритания) методом бомбардировки помещенных в глицериновую матрицу веществ пучками ускоренных атомов Хе с энергией 8 кэВ (метод FАВ-МS).
Далее...
Написать комментарий
|
