Генетические механизмы устойчивости актиномицетов к аминогликозидным антибиотикам

Львовский университет им. И. Франко, Украина

В начало...

Представители рода Micromonospora - продуценты 2-дезоксистрептаминовых АГ - M.purpurea, M.zionensis, M.inyoensis, M.rosea в отличие от S.tenebrarius и S.kanamyceticus, имеют один механизм защиты от собственных антибиотиков - модификацию 16S рРНК. Предполагается, что сайтом действия их метилаз также является G-1405. Интересно, что содержание GC-пар в гене gmrA M.purpurea ниже (64%), чем средний GC-состав генов Streptomyces (73%). Однако процент GC-пар в первой, второй и третьей позициях кодонов (соответственно 65, 46 и 82%) соответствует показателям для генов с высоким GC-составом [49-52].

Гены, гомологичные gmrA, обнаружены в геномах еще пяти штаммов Micromonospora: M.inyoensis, M.danubiensis, M.rhodorangea, M.zionensis и M.rosea [51]. Из продуцентов сизомицина M.rosea и 6'-N-метилсизомицина (G-52) M.zionensis были клонированы гены, обозначенные соответственно как gmr [52] и sgm [53]. Гены gmr M.purpurea и M.rosea и кодируемые ими метилазы имеют высокий уровень гомологии. Идентичными являются 90,4% нуклеотидов в генах и 89,4% аминокислотных остатков в их продуктах. Сравнение аминокислотных последовательностей продуктов генов sgm и grm, sgm и kgmB, sgm и kamB показало наличие соответственно 90, 54 и 23% идентичных аминокислотных остатков [53]. Гены grm M.purpurea и М.rosea и расположенные рядом с ними ORF, продукты которых не идентифицированы, транскрибируются в виде единой мРНК. Указанные ORF обоих видов характеризуются высокой гомологией. Предполагают, что эти ORF могут быть генами биосинтеза соответствующих антибиотиков [52, 53]. Интересно, что гены grm, sgm и kgm только при клонировании в М.melanosporea определяют иной, чем в исходных штаммах, спектр устойчивости к АГ: этот реципиент становится устойчивым еще и к гигромицину В. Таким образом, экспрессия этих генов имеет штаммоспецифический характер [54].

Сравнение разных SAM-зависимых метилтрансфераз показало, что за связывание с SAM может отвечать глицин-богатый район фермента [55]. Однако метилазы 16S рРНК, детерминируемые генами sgm, grm и kgm, не имеют таких глицин-богатых участков. Одним из возможных объяснений этой разницы между метилазами 16S рРНК и двумя классами SAM-зависимых метилаз, которые метилируют 23S рРНК и ДНК, является то, что ферменты этих двух классов используют как субстрат свободные нуклеиновые кислоты, в то время как метилазы 16S рРНК узнают лишь 30S субьединицы, а не свободную 16S рРНК и не 70S рибосомы. Поскольку ферменты имеют разные субстраты, то и строение сайтов связывания с кофактором также может быть разным [53]. Анализ аминокислотных последовательностей метилаз 16S рРНК S.kanamyceticus, M.purpurea, M.zionensis, S.tenebrarius, M.olivasterospora показало наличие в них нескольких протяженных высококонсервативных мотивов, имеющих, очевидно, важное значение для функционирования этих ферментов [41].

У продуцента спорарицина Saccharopolyspora hirsuta CL102 обнаружен ген kamC, гомологичный kamB гену S.tenebrarius. Показан высокий уровень гомологии (65%) аминокислотных последовательностей метилаз, кодируемых генами kamB и kamC. Третий ген kam-типа (kamA) клонирован из S.tеnjimariensis - продуцента истамицина. Продукт этого гена вызывает метилирование А-1408 16S рРНК. Ген kamA S.tenjimariensis и гены kamB S.tenebrarius и kamC S.hirsuta гомологичны, о чем свидетельствует гибридизация между ними [47, 59].

У продуцентов фортимицинов идентифицированы и охарактеризованы два типа генов резистентности к АГ. Три гена - fmrТ y S.tenjimariensis, fmrS у S.sannanensis и fmrH у S.hirsuta детермируют устойчивость к фортимицину, канамицину и неомицину, но не к гентамицину (fmrT-тип устойчивости). В то же время гены fmrО у M.olivasterospora, fmrM у Micromonospora sp. SF-2098 и fmrD y Dactylosporangium matsuzakiense определяют резистентность к фортимицину А, канамицину и гентамицину, но не к неомицину (fmrО-тип устойчивости). Гомология между этими двумя типами генов резистентности в экспериментах по блот-гибридизации не обнаружена [56]. Для гена fmrT у S.tenjimariensis, а также генов kamC у S.hirsuta CL102 и kamB у S.tenebrarius

характерен высокий уровень гомологии (66,3 и 72,8% идентичных нуклеотидов соответственно). Данные гибридизации позволили авторам предположить, что гены fmrT и kamA идентичны, хотя наблюдаются некоторые отличия в их физических картах [59].

Ген fmrО M.olivasterospora кодирует метилазу, модифицирующую 16S рРНК. Этот белок и продукты генов gmrA М.purpurea и М.rosea содержат соответственно 30,8% и 35% идентичных аминокислот. Ген fmrО входит, очевидно, в оперон, включающий еще два гена. В районе генома, прилегающем к fmrО, находятся по меньшей мере 10 генов биосинтеза фортимицина А [57]. Существование двух семейств отличающихся между собой генов резистентности к фортимицинам указывает на то, что гены биосинтеза фортимицинов и гены устойчивости продуцентов к ним эволюционировали независимо. В геноме M.purpurea обнаружен ген, гомологичный fmrО и отличный от grm, который и определяет его устойчивость к фортимицину. Предполагают, что ген fmrО M.olivasterospora и оба гена АГ-резистентности M.purpurea имеют общее эволюционное происхождение [58]. Интересно, что устойчивость продуцента касугамицина S.kasugaensis к фортимицинам определяется ААС(2'), способной ацетилировать фортимицины в двух различных сайтах - 1-NH2 истамицина В и 2'-NH2 фортимицина А и истамицина А [31].

В отличие от генов, контролирующих ферментативную модификацию АГ и широко встречающихся как среди актиномицетов, так и среди других бактерий, гены метилаз 16S pPHK, определяющие устойчивость к АГ, не идентифицированы у клинических штаммов бактерий [1]. Бактерии, как правило, имеют множественные гены рРНК, поэтому мутации отдельных генов рРНК, обусловливающие АГ-резистентность, могут не проявляться на фенотипическом уровне. С другой стороны, у штаммов-продуцентов АГ, например у S.kanamyceticus, процесс метилирования индуцируется во время биосинтеза антибиотика в стационарной фазе роста, то есть это регулируемый процесс. Горизонтальный перенос гена метилазы рРНК в другие микроорганизмы может приводить к конститутивной экспрессии этого гена, что негативно влияет на синтез белка, рост и деление клетки. Это, очевидно, может вызывать постепенную элиминацию такого гена из популяции. Таким образом, если гены ферментативной инактивации АГ при помощи горизонтального переноса могут распространяться среди бактерий, то этот процесс для генов рибосомальной АГ-устойчивости встречает ряд ограничений.

В заключение обзора следует отметить, что гены, кодирующие АГ-ацетил- и фосфотрансферазы у актиномицетов, и продукты этих генов по своему строению близки к аналогичным генам и белкам клинических штаммов, хотя прямых доказательств переноса этих генов между указанными культурами нет. Почти во всех хорошо изученных случаях гены устойчивости актиномицетов к АГ имеют хромосомную локализацию, сцеплены с генами биосинтеза соответствующего антибиотика и их экспрессия подвержена совместной регуляции. В ряде случаев показано, что гены резистентности, как например ген aphD у S.griseus, прямо участвуют в биосинтезе антибиотиков. Однако для большинства продуцентов АГ такое участие генов резистентности еще не доказано.

Данные литературы показывают, что уровень АГ-резистентности штаммов-продуцентов лимитирует их антибиотическую активность. Поэтому информация о структуре и функции генов АГ-резистентности имеет большое значение для селекции высокоактивных продуцентов АГ. В литературе приводится очень мало данных об использовании признаков резистентности к АГ в селекции их продуцентов. Также крайне мало имеется информации о мутациях как генов, контролирующих ферменты модификации АГ, так и генов метилаз 16S рРНК, о влиянии этих мутаций на функции соответствующих белков, спектр антибиотикорезистентности и на антибиотическую активность продуцентов. Изучение мутаций генов АГ-резистентности у актиномицетов может использоваться также и как модель для прогнозирования мутационных изменений аналогичных генов других бактерий, в частности возбудителей инфекционных заболеваний.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N9, стр. 29-36.

ЛИТЕРАТУРА

2. Shaw К. J. , Rather P.N., Hare R.S., Miller G.N. Microbiol Rev 1993; 57: 138-163.

3. Даниленко В.Н., Пузынина Г.Г., Ломовская Н.Д. Генетика 1977; 13: 5-9.

4. Cundliffe Е. Annu Rev Microbiol 1989: 43: 207-233.

5. Грязнова Н.С., Таисова А.С., Белявская И.В. Антибиотики и мед биотехнол 1985; 30: 253-257.

6. Thompson С.J., Skinner R.H. Thompson J. et al. J Bacteriol 1982; 151: 678-685.

7. Salauze D., Peres-Gonzales J., Pipersberg W., Davies J. Gene 1991; 101: 143-148.

8. Lopez-Cabrera M., Perez-Gonzalez J.A., Heinzel P. et al. J Bacteriol 1989; 171: 321-328.

9. Bibb J., Ward J. Mol Gen Genet 1985; 199: 26-36.

10. Retzlaff L., Mayer G., Beyer S. et al. In: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics. Washington 1993; l83-194. 11. Ferretti J.J., Gilmore K.S., Courvalin P. J Bacteriol 1986; 167: 631-638.

12. Hotta K., Yamamoto H., Okami Y., Umezawa H. J Antibiot 1981; 34: 1175-1182.

13. Yamamoto H., Hotta K., Okami Y. J Antibiot 1982; 35: 1020-1025.

14. Satoh A.S., Ogawa H. Agric Biol Chem 1975; 39: 1593-1598.

15. Satoh A.S., Ogawa H., Satomura Y. Agric Biol Chem 1976; 40: 191-196.

16. Murakami T., Nojiri C., Toyama H. J Antibiot 1983; 36: 1305-1311. 17. Crameri R., Davies J.E. J Antibiot 1986; 39: 128-135.

18. Pardo J.M., Malpartida F., Rico M., Jimenes A. J Gen Microbiol l985; 131: 1289-1298.

19. Zalacain M., Gonzalez A., Guerrero M. Nucl Acids Res 1986; 14: 1565-1581.

20. Lutzkanova D., Distler J., Altenbuchner J. Microbiology 1997; 143: 2135-2143.

21. Ohnuki T., Imanaka T., Aiba S. J Bacteriol 1985; 164: 85-94. 22. Heinzel P., Werbitzky O., Distler J. Arch Microbiol 1988; 150: 184-192.

23. Vogtli H., Hutter R. Mol Gen Genet 1987; 208: 195-203.

24. Matsuhashi Y., Murakami T., Nojiri C. J Antibiot 1985; 38: 279-283. 25. Mansouri K., Piepersberg W. Mol Gen Genet 1991; 228: 459-469. 26. Distler J.A., Ebert A., Mansouri К. Nucl Acids Res 1987; 15: 8041-8056.

27. Beppu T. EMBO J 1995; 13: 264-269.

28. Lezhava A., Kamaoka D., Sugino H., Shinkawa H. Mol Gen Genet 1997; 253: 478-483.

29. Hinterman G., Crameri R., Vogtli M. Mol Gen Genet 1984; 196: 513-520.

30. Hotta К., Ishikawa J., Ichihara M., Naganawa K., Mizuno S. J Antibiot 1988: 41: 94-103.

31. Hotta К., Ishikawa J., Ogata Т., Mizuno S. Gene 1992; 115: 113-117.

32. Ishakawa J., Hotta K. Gene 1991; 108: 127-132.

33. Потехин Я.А., Даниленко В.Н. Молекул биол 1985; 19: 805-817.

34. Danilenko V.N., Akoniants K.E. Proc Ninth Int Symp Biol Actinom. Moscow 1994; 104-112.

35. Hornemann U., Xiao Yu Zhang. Proc Ninth Int Symp Biol Actinom. Moscow 1994; 120-125.

36. Zavorotna S., Fedorenko V. 7th Int Symp Gen Ind Microor. Montreal 1994; 252.

37. Beauclerk A.A.D., Cundliffe E. J Mol Biol 1987; 193: 661-671. 38. De Stasio E.A., Moared D., Noller H.F. EMBO J 1989; 8: 1213-1216.

39. Li M., Tzagaloff A., Underbrink-Lion K., Martin N.C. J Biol Chem 1982; 257: 5927-5928.

40. Nakano M., Mashiko H., Ogawara H. J Bacteriol 1984; 157: 79-83.

41. Demydchuk J., Oliynyk Z., Fedorenko V. J Basic Microbiol 1998; 38: 243-251.

42. Nakano M., Butsuya I., Ogawara H. J Antibiot 1989: 42; 423-430.

43. Федоренко В.А., Голец Л.М., Демидчук Ю.А., Крюгель Г. Антибиотики и химиотер 1998; 43: 4: 14-19.

44. Holms D., Cundliffe E. Mol Gen Genet 1991; 229: 229-237.

45. Skeggs P.A., Holmes D.J., Cundliffe E. J Gen Microb l987; 133: 915-923.

46. Denoya С.D., Bechafer D.H., Dubnau D. J Bacteriol 1986; 168: 1133-1141.

47. Holmes D.J., Drocourt D., Tiraby G., Cundliffe E. Gene 1991; 102: 19-26.

48. Kim J.W., Hyun C.G., Han J.J. et al. 10th Int Symp Biol Actinom: Abstr Book. Beijig 1997; 2P2.

49. Piendl W., Bock A., Cundliffe E. Mol Gen Genet 1984; 197: 24-29.

50. Thompson J., Skeggs P., Cundliffe E. Mol Gen Genet 1985; 201: 168-173.

51. Cundliffe E. Gene 1992; 115: 75-84.

52. Kelemen G., Cundliffe E., Financsek I. Gene 1991; 98: 53-60. 53. Kojic M., Topisirovic L., Vasiljevic B. J Bacteriol 1992; 174: 7868- 7872.

54. Kojic M., Milojevic N., Vasiljevic В. 10th Int Symp Biol Actynom: Abstr book. Beijig 1997; 1P18.

55. Haydock S.F., Dowson J.A., Dhillon N. et al. Mol Gen Genet 1991; 230: 120-128.

56. Ohta T., Dairi T., Hasegawa M. J Gen Microbiol 1993; 139: 591- 599.

57. Dairi T., Ohta T., Hashimoto E., Hasegawa M. Mol Gen Genet 1992; 232: 262-270.

58. Ohta T., Hasegawa M. Gene 1993; 127: 61-69. 59. Ohta T., Hasegawa M. J Antibiot 1993; 46: 511-517.

60. Skeggs P.A., Thompson J., Cundliffe E. Mol Gen Genet 1985; 204: 415-421.

61. Shinafuji H., Matsumura S., Nogami I. Agric Biol Chem 1982; 46: 3081-3084.

62. Perez-Gonzales J.A., Jimenez A. Biochem Biophys Res "Com 1984; 125: 895-901.

63. Hoshiko S., Nojiri K., Matsunaga K. et al. Gene 1988; 68: 285-296.

64. Davies J., Houk C., Yagisawa M., White T.J. In: Genetics of Ind Microorg. Washington 1979; 166-169.

65. Walker J.B., Scorvaga M. J Biol Chem 1973; 248: 2435-2440. 66. Goldberg S.L., Romero J.G., Dep S.L. J Antibiot 1990; 43: 992-999.