|
И.А. Воробьева, Е.Е. Брагина, Ж.В. Cтепанова Центральный научноисследовательский кожновенерологический институт МЗ РФ, Москва, Россия.
Иммунопатология, аллергология, инфектология N3-2001, с.77-82.
Приводятся результаты электронно-микроскопического изучения влияния флуконазола на ультраструктуру Trichophyton rubrum. Выявлены выраженные деструктивные изменения в морфологической картине культуры, что обосновывает высокую эффективность препарата в терапии онихомикоза.
Ключевые слова:
Флуконазол - азоловое соединение с широким спектром противогрибковой активности, синтезированный в начале 80-х годов фармацевтической компанией "Pfizer", широко применяется в терапии микозов благодаря своей высокой эффективности и высокому профилю безопасности [1, 2]. Флуконазол использовался, в основном, для лечения кандидоза, в том числе и генерализованных его форм с поражением центральной нервной системы [3].
Эффективность флуконазола при грибковых поражениях ЦНС, обусловленных Candida и Cryptococcus, обусловлена его гидрофильностью и возможностью быстро проникать через гемато-энцефалический барьер [4]. Несколько позже микологи стали изучать клиническую эффективность флуконазола при поверхностных микозах [5, 6, 7], в том числе и онихомикозе [8, 9]. За рубежом более широко, чем в России данный препарат используется в терапии грибковых поражений ногтей.
Одним из методов оценки влияния антимикотика на возбудителя грибкового заболевания является ультраструктурное исследование. Однако мы не нашли работ, посвященных влиянию флуконазола на ультраструктуру Trichophyton rubrum, являющегося основным возбудителем микозов стоп во всем мире. Подробно изучено влияние флуконазола лишь на ультраструктуру Candida и Cryptococcus neoformans [10, 11].
Материалы и методы. Изучение воздействия флуконазола проводили на 14-дневных культурах Trichophyton rubrum, выделенных от больных онихомикозом. Культуры грибов инкубировали в термостате при температуре 37?С на среде Сабуро с добавлением хлорамфеникола и тиамина. Флуконазол вносили в чашки Петри c культурой Trichophyton rubrum. Материал для исследования брали через 3, 8, 12, 16 и 20 дней после внесения препарата, а также для контроля- 14- и 34-дневную культуры. Фрагменты колоний с агаром фиксировали 2,5% раствором глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 3 часов при температуре 4?С. Затем материал дофиксировали 1% осмиевой кислотой в течение 1 часа при 4?С и дегидратировали [12, 13 ]. Высушивали методом обхода критической точки СО2 с последующим напылением сплавом золота и палладия слоем 200 А на ионно-распылительной установке фирмы Eiko. Подготовленные образцы просматривали в растровом электронном микроскопе Hitachi S 405 A при ускоряющем напряжении 15 кВ.
Исследованию подлежал бархатистый штамм T.rubrum, наиболее часто выделяемый нами при грибковой инфекции ногтей. Данный штамм отличается от других незначительным спорообразованием.
Результаты и их обсуждение
Двухнедельная культура Trichophyton rubrum представлена переплетением гиф как с округлым сечением, так и слегка уплощенной формы. В препаратах присутствуют немногочисленные округлые споры.
До воздействия флуконазола на культуру определялись густо переплетенные между собой гифы. Некоторые гифы на своей поверхности содержат большое количество формирующихся спор (рис.1-3).
 |
Рис. 1-3.
Сканограмма зрелой 2-недельной культуры Trichophyton rubrum. Г - гифы с округлым поперечным сечением, Г1 - уплощенные. С - споры; Гс - гифы с формирующимися спорами. |
Морфологическая картина культуры после 3-дневного воздействия флуконазолом мало отличается от контрольной: также присутствуют гифы с округлым сечением и уплощенные, сегменты которых разделены перегородками-септами, имеющими вид выпулых колец. На поверхности гиф отмечаются единичные кратерообразные углубления (рис.4-5).
 |
Рис. 4-5.
Культура Trichophyton rubrum после 3-дневного воздействия флуконазола. Г - гифы с округлым поперечным сечением, Г1 - уплощенные. К -единичные кратерообразные углубления на поверхности гиф. П - перегородка (септа), разделяющая гифы на сегменты. |
На рис.6-7 представлена культура Trichophyton rubrum после 8 дней воздействия флуконазола. Присутствуют оба типа гиф, но преобладают уплощенные формы с более выраженными кратерообразными углублениями на поверхности. Выявлены единичные споры.
 |
Рис. 6-7.
Культура Trichophyton rubrum, находящаяся 8 дней под воздействием флуконазола. Г1 - уплощенные гифы; К - кратерообразные углубления на поверхности гиф; С - единичная спора. |
Культура, находящаяся под воздействием антимикотика в течение 12 дней, характеризуется переплетением перекрученных, деформированных, уплощенных гиф с кратерообразными изменениями их поверхности. Споры отсутствуют (рис.8-9).
 |
Рис. 8-9.
Сканограмма культуры Trichophyton rubrum после 12 дней воздействия флуконазола. Гд - деформированные, перекрученные, уплощенные гифы с выраженными кратерообразными углублениями (К) на поверхности. |
После 16-дневного воздействия флуконазола на Trichophyton rubrum отмечаются полностью уплощенные гифы, лишенные септ, покрытые аморфным материалом. Споры и их зачатки отсутствуют, что свидетельствует о невозможности дальнейшего развития культуры (рис. 10).
В культуре, находящейся в течение 20 дней под воздействием флуконазола, наблюдается полная деструкция гиф возбудителя: они полностью уплощены , перекручены, слипшиеся между собой, покрыты аморфным веществом, без зачатков микроконидий (рис. 11).
 |
Рис. 10-11.
Сканограмма культуры Trichophyton rubrum после 16 дней воздействия флуконазола. Гд - уплощенные гифы, лишенные септ, покрытые аморфным веществом (А). |
Контрольная культура (возраст-34 дня) вполне жизнеспособна: содержит как гифы с округлым поперечным сечением, так и слегка уплощенные. На окончаниях гиф присутствуют точки роста (рис.12-12а).
 |
Рис. 12-12А.
Контрольная культура (возраст-34 дня). Г - интактные гифы с округлым поперечным сечением, Г1 - слегка уплощенные гифы, Т - точка роста культуры. |
Заключение
Проведенное исследование детально характеризует изменения Trichophyton rubrum в культуре, находящейся под воздействием антимикотика флуконазола в различные сроки роста возбудителя. Показаны глубокие деструктивные изменения ультраструктуры гриба на 20-й день воздействия препарата, проявляющиеся в полном уплощении, перекручивании гиф возбудителя, покрытии их аморфным веществом, отсутствии признаков роста гиф, зачатков споробразования на их поверхности и отдельных спор. Данные признаки свидетельствуют о высокой степени противогрибковой активности флуконазола в отношении Trichophyton rubrum, а также обосновывают эффективность его клинического применения при онихомикозе.
1. Stevens D.A., Diaz M., Negroni R., Montero Gei F., Castro L.G.M. at al. Safety evaluation of chronic fluconazol therapy. Chemotherapy 1997; 43: 371-7.
2. Баранцевич Е.П. Системные микозы: терапия новым антифунгальным препаратом дифлюканом. Клинич. медицина, 1996; 74; N4:52-4.
3. Буслаева Г.Н. Лечение различных форм кандидоза новорожденных и детей раннего возраста. Вестн. дерматол. и венерол. 1997; N4:58-60.
4. Grant SM, Clissold SP. Fluconazole: review of its pharmacodinamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic potential superficial and systemic mycoses. Drugs, 1990; 39:877-916.
5. C. De Cuyper, Amblard P., Austad J., Bazex J., Bohmann P., at al. Noncomparative study of fluconazole in the treatment of patients with common fungal infections of the skin. Int J of Dermatol, Suppl 2; Nov 1992:17-20.
6. Mohamed A. Amer at al. Fluconazole in the treatment of Tinea versicolor. Int J Dermatol; 1997; 36: 940-2.
7. Suchil P., Montero Gei F., Robles M., Perera- Ramires A., Welsh O., Male O. Once- weekly oral doses of fluconazole 150 mg in the treatment of Tinea corporis/ cruris and cutaneus candidiasis. Clin Exp Dermatol; 1992; 17: 397-401.
8. Scher RK, at al. Once-weekly fluconazole (150, 300, or 450 mg) in the treatment of distal subungual onychomycosis of the toenail. J Am Acad Dermatol; 1998 Jun: 38 (6 Pt 2):77-86.
9. Ling MR, at al. Once-weekly fluconazole (450 mg) for 4, 6, or 9 months of treatment for distal subungual onychomycosis of the toenail. J Am Acad Dermatol; 1998 Jun: 38 (6 Pt 2):87-94.
10. Gull K, Marriott MS, Troke PF. The effect of the fluconazole on the morfology and ultrastructure of Candida albicans in vitro and in vivo. 1986 (Abstract, 26 th ICAAC, New Orleans, Sep 26- Oct 1, 1986).
11. Troke PF, Smith MJ. The in vitro and in vivo activity of fluconazole against Cryptococcus neoformans. 1 987 (Abstract, 27 th ICAAC, New York, Oct 4-7, 1987).
12. Делекторский В.В., Шеклаков Н.Д., Шадыев Х.К. Ультраструктура М. canis до и после воздействия гризеофульвина. Вестн. дерматол. и венерол. 1976; N7:32-5.
13. Тихонова О.В., Перламутров Ю.Н., Ющук Н.Д., Брагина Е.Е. Ультраструктурные изменения Trichophyton rubrum под воздействием итраконазола (орунгала). Вестн. дерматол. и венерол., 1999; N5:16-8.
Написать комментарий
|
