|
Н.В. Пивень1, В.В. Новиков2, Л.Н. Лухверчик3, Е.И. Кузьменкова4 1Институт биоорганической химии НАН Б,
2Нижегородский государственный университет им .Н.И.Лобачевского, Россия
3Международный экологический университет им.А.Д.Сахарова,
4Республиканский консультативный эндокринологический центр МЗ РБ, Минск, Беларусь
Иммунопатология, аллергология, инфектология N3-2001, с.15-20.
В начало...
С целью изучения патогенетической роли нарушений механизмов апоптоза при различных формах патологии щитовидной железы (ЩЖ) изучена концентрация растворимой формы Fas-рецептора (FasR,CD95) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) на основе моноклональных антител (МАТ) у лиц со скрытым и клинически выраженным гипотиреозом, а также у больных раком ЩЖ. Обнаружено повышение концентрации FasR при различных формах гипотиреоза и снижение у больных с онкопатологией ЩЖ. Сделан вывод о взаимосвязи характера патологического процесса и концентрации FasR в крови, которая может служить количественным маркером нарушений механизмов апоптоза при патологии ЩЖ.
Ключевые слова:
В последние годы одной из актуальных проблем экспериментальной и клинической медицины является изучение патогенетической роли нарушений молекулярных механизмов апоптоза в развитии целого ряда заболеваний. Показано существование взаимосвязи между нарушениями регуляции процесса апоптоза и развитием онкологических, аутоиммунных и других заболеваний [1], сопровождаемое снижением эффективности иммунологического надзора. Исследования целого ряда авторов выявили новые механизмы подавления иммунологического надзора, связанные с апоптозом и Fas-антигеном-рецептором (FasR, APO-1, CD 95) [2].
FasR относится к рецепторным белкам семейства факторов некроза опухолей - ФНО. Он экспрессируется на поверхности многих типов клеток: тимоцитов, фибробластов, гепатоцитов, кератиноцитов, активированных Т- и В-лимфоцитов [3,4]. FasR у человека состоит из 335 аминокислотных остатков и относится к мембранным белкам 1 типа. В его структуре выделяют внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический домены [5]. Примерно 80 аминокислотных остатков образуют домен клеточной смерти, который, участвуя в белок-белковом взаимодействии с цитоплазматическими белками, генерирует сигнал разрушения клетки [6]. Основная функция системы Fas-рецептор-Fas-лиганд (FasL) - индукция апоптоза в клетках [7]. При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков, в результате чего активируется апоптозоспецифическая протеаза (каспаза-8) и развиваются характерные для апоптоза процессы [8]. Таким образом, взаимодействие FasR с FasL (или моноклональными антителами к FasR) приводит к запуску апоптоза в клетке [9].
Менее изучена значимость растворимых сывороточных форм FasR, которые образуются либо за счет протеолитического расщепления мембранных форм (shedding - шеддинг), либо за счет альтернативного сплайсинга мРНК, приводящего к образованию транскрипта, соответствующего растворимой форме. Чаще всего это укороченный транскрипт, не содержащий участка, соответствующего трансмембранному региону [10]. Механизмы регулирующего действия растворимых форм FasR в организме могут быть различными и еще до конца не изучены. Первоначально считалось, что растворимые формы блокируют связывание мембранной формы FasR с Fas-лигандом за счет взаимодействия с FasL в кровотоке. Однако в настоящее время существуют сведения об участии растворимых форм FasR в защите FasL от деградации, передаче проапоптотического сигнала и запуске апоптоза. Сам факт сброса FasR с мембраны при протеолитическом шеддинге может приводить к модуляции иммунных реакций и возникновению различных эффектов, участвующих в патогенетических механизмах, с одной стороны, и вносящих свой вклад в нарушение гомеостаза - с другой [11].
Целью настоящей работы было изучить концентрацию растворимой формы Fas-рецептора методом иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител (мАТ) и оценить ее клинико-диагностическую и патогенетическую роль при различных формах патологии ЩЖ (субклинический гипотиреоз, аутоиммунный тироидит, рак).
Материалы и методы. Было обследовано 72 человека в возрасте от 18 до 40 лет: 32 человека - со скрытым доклиническим гипотиреозом, 20 - лица с клинически выраженным гипотиреозом (аутоиммунный тиреоидит), 9 - больные, прооперированные по поводу рака ЩЖ, контрольную группу составили здоровые лица (11 человек) того же возраста. У всех обследованных лиц методом радиоиммуноанализа предварительно был изучен тироидный статус путем оценки концентрации тироидных гормонов - тиротропного гормона (ТТГ), трийодтиронина (Т3), тироксина (Т4) и белков - тироксинсвязывающего глобулина (ТСГ), тироглобулина (ТГ).
Концентрацию FasR (CD95) в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа на основе МАТ у этих же лиц по следующей схеме. Вначале стрипы сорбировали первыми МАТ к FasR, внося по 100 мкл в каждую лунку с последующей инкубацией в течение 18-20 часов при t 20-260С во влажной камере. После четырехкратной промывки фосфатно-солевым буферным раствором с добавлением твин-20, рН 7,0 0,5 (ФСР-Т) во все лунки вносили по 100 мкл 2% раствора пептона и вновь инкубировали во влажной камере при 20-260С в течение одного часа. После проведения четырехкратного промывания вносили в лунки контрольные и анализируемые образцы сывороток крови (100 мкл); для контроля конъюгата в 3 лунки вносили по 100 мкл раствора ФСР-Т. Проводили инкубацию в течение 18-20 часов при 20-260С, закрыв стрипы крышкой. Затем пробы промывали 6 раз и вносили по 100 мкл приготовленного непосредственно перед применением вторых МАТ против FasR, меченных пероксидазой хрена. Инкубировали во влажной камере в течение 1 часа с последующим промыванием (6 раз). Затем вносили по 100 мкл субстрата (перекись водорода) и ортофенилен диамина, растворенного в цитратном буфере (рН 5 0,5), и выдерживали пробы в течение 8-10 мин при 20-260С. После этого добавляли по 50 мкл 15%-ного раствора H2SO4 и немедленно проводили учет результатов анализа. Результаты оценивали на основании калибровочной кривой (рис. 1), отражающей зависимость оптической плотности от концентрации контрольного образца сыворотки с определенным содержанием FasR (принимая оптическую плотность разведения 1:2 за 1000 условных единиц).
 |
Рисунок 1. Калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации Fas-R в калибровочных пробах |
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерных программ "BIOSTAT" и "EXEL".
Результаты и обсуждение
Проведенное нами комплексное клинико-лабораторное обследование позволило разделить всех обследованных лиц на 4 группы в соответствии с общепринятой классификацией [12,13]: здоровые лица, лица с доклиническим гипотиреозом, больные с клинически выраженной гипофункцией ЩЖ на фоне аутоиммунного тироидита (АИТ) и больные с различными формами рака ЩЖ (табл. 1).
| Таблица 1. Тироидный статус обследованных лиц (M m) |
| Обследуемые группы |
Т3 общ. нмоль/л |
Т4 общ. нмоль/л |
ТТГ мМЕ/л |
ТСГ мг/л |
ТГ нг/мл |
| Здоровые лица (n=11) |
2,12 0,09 |
109,2 6,8 |
1,31 0,19 |
23,1 1,5 |
24,6 2,4 |
| Субклинический гипотиреоз (n=32) |
2,1 0,16 |
129,97 9,5* |
3,14 0,39* |
24,2 1,35 |
6,54 0,7* |
| АИТ с клинически выраженным гипотиреозом (n=20) |
1,78 0,15* |
80,65 6,9* |
20,15 2,3* |
68,1 2,14 |
9,1 0,9* |
| Рак ЩЖ, (n=9) |
2,48 0,61 |
134,19 13,8 |
3,66 0,97* |
39,7 9,29 |
38,2 8,4 |
| * - достоверность различий (p<0,05) по сравнению с контрольной группой. |
Субклинический гипотиреоз характеризовался повышением уровня ТТГ на фоне нормального содержания Т4, Т3 и ТСГ, а клинически выраженный гипотиреоз - повышением уровня ТТГ и ТСГ, снижением уровня Т3 и Т4. Больные раком ЩЖ на момент обследования получали заместительную терапию тироксином (Т4) для коррекции послеоперационного гипотиреоза.
Далее...
Написать комментарий
|
