|
О.А. Леонтьева, О.А. Воробьева
НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН
Проблемы репродукции, 3-1999, с.29-36
В начало...
Для оценки морфологии использованы два различных методических подхода: стандартный и учитывающий все аномалии, имеющиеся у конкретной клетки. Показано, что анализ морфологии с учетом всего комплекса патологий, характерных для каждого сперматозоида, более адекватно описывает клеточную популяцию и динамику ее изменения. С использованием данного методического подхода установлено, что при выделении фракции подвижных сперматозоидов происходит снижение частоты встречаемости аномалий хвоста, акросомальной области, изменений формы ядра, размера и удвоений головки, патологии шейки и срединного отдела, а также незрелых форм.
Ключевые слова:
В отличие от других млекопитающих для человека характерен высокий уровень морфологической гетерогенности сперматозоидов. Было показано, что морфологически аномальные сперматозоиды обладают рядом биологических особенностей, понижающих их оплодотворяющую способность. В частности, они имеют более низкую по сравнению с нормальными клетками способность к пенетрации лишенных блестящей оболочки ооцитов хомяка [1], меньшую скорость прямолинейного движения и частоту биения хвоста [2, 3]. У морфологически аномальных клеток изменена реакция гиперактивации при капацитации, а также акросомальная реакция [4]. Также у них чаще отмечаются аномалии хроматина [5], а при некоторых формах патологии головки наблюдается повышение уровня структурных хромосомных аберраций [6], что может оказывать влияние на последующее развитие эмбрионов.
Изучению взаимосвязи морфологии сперматозоидов с мужским бесплодием в настоящее время посвящено большое число работ. Несмотря на то, что полученные данные достаточно противоречивы [7], влияние повышения в эякуляте доли аномальных сперматозоидов на снижение частоты наступления беременности показано как в условиях естественного зачатия [8], так и при использовании вспомогательных репродуктивных технологий: методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [9-11] и внутриматочной инсеминации [12]. В программе ЭКО, позволяющей количественно проанализировать взаимосвязь различных параметров с мужским бесплодием, установлено, что морфология сперматозоидов, оцененная в соответствии с жесткими критериями нормы, разработанными Крюгером и соавторами [10, 11], является важным прогностическим признаком для оценки вероятности оплодотворения в культуре, а также частоты наступления беременности. Поэтому, одним из направлений оптимизации программы ЭКО является разработка методов, позволяющих с наибольшей эффективностью выделить из эякулята фракцию прогрессивно подвижных сперматозоидов, используемую для инсеминации ооцитов, которая имела бы наилучшие показатели кинематики и морфологии.
В большинстве лабораторий для получения подвижной фракции используется метод всплытия (swim-up), либо фракционирование эякулята в градиенте плотности перколла. Применение перколла позволяет более полно выделить из нативного эякулята прогрессивно подвижные сперматозоиды [13, 14]. В то же время популяция сперматозоидов, полученная при использовании метода всплытия, характеризуется лучшими кинематическими параметрами [13, 15]. Относительно того, какой из способов выделения фракции подвижных клеток в большей степени повышает долю морфологически нормальных сперматозоидов, нет единого мнения. Имеются указания как на преимущества использования перколла [16], так и всплытия [13], а также равную эффективность этих методов [15].
В данной работе нами была использована комбинированная методика выделения фракции прогрессивно подвижных форм, которая заключалась в последовательном применении центрифугирования в перколле и дальнейшего всплытия сперматозоидов из полученного осадка. Эта модификация позволяет сочетать преимущества обеих методик [13]. В частности, ранее нами было показано, что при этом эффективно повышается доля сперматозоидов с нормальной структурой хроматина [17]. В настоящей работе исследовано изменение морфологических параметров мужских половых клеток при выделении прогрессивно подвижной фракции комбинированным способом.
Следует отметить, что основной методической сложностью такого рода исследований является как отсутствие единого морфометрического стандарта нормального сперматозоида, так и универсальной схемы классификации морфологических патологий. Традиционно каждый аномальный сперматозоид относят к определенному единственному типу патологии. Такая классификация не позволяет объективно описать популяцию клеток, в связи с тем, что некоторые спер-матозоиды могут иметь несколько аномалий одновре-менно. В данной работе нами использован как стандартный подход к оценке морфологии (основанный на критериях нормы, предложенных Крюгером и соавторами [10, 11], и разработанной нами системе классификации аномалий), так и новый подход, позволяющий количественно описать весь спектр наблюдаемых аномалий даже при наличии у сперматозоида сочетанной патологии.
Цель данной работы состояла в том, чтобы, используя различные методы оценки морфологии, исследовать изменение соотношения различных морфологических типов сперматозоидов при выделении из нативного эякулята фракции подвижных форм комбинированным способом.
Материал и методы
Сравнительный анализ морфологии сперматозоидов нативного эякулята и прогрессивно подвижной фракции проведен на образцах спермы, полученных у 57 пациентов, проходивших обследование по поводу бесплодия. У 30 пациентов показатели спермограммы соответствовали норме, в одном случае выявлена олиго-, в 22 - астено- и в 4 - олигоастенотератозооспермия.
Выделение из нативного эякулята фракции прогрессивно подвижных форм осуществляли в изотоническом 90% перколле, приготовленном по методике Кохена [18], с последующим проведением процедуры всплытия.
Морфологию сперматозоидов оценивали при увеличении 1000 по тотальным, окрашенным гематоксилин-эозином препаратам. Для морфологически нормального сперматозоида характерна овальная форма головки, длина ее составляет 5-6 мк, ширина 2,5-3,5, акросомальный участок занимает от 40 до 70% площади головки, при этом отсутствуют аномалии шейки, хвоста и срединного отдела. Пограничные формы (сперматозоиды с легкой патологией) имеют слегка удлиненную головку диаметром 2-2,5 мк или небольшие утолщения в области шейки при нормально выраженном акросомальном участке.
В данной работе морфология сперматозоидов была проанализирована с помощью двух различных методических подходов:
1. При использовании первого - стандартного метода, каждый сперматозоид относили к определенному, только одному, морфологическому типу в соответствии с классификацией, проиллюстрированной на рис. 1. При этом частоты всех морфологических типов сперматозоидов для каждого конкретного случая в сумме составляют 100%.
2. В соответствии со вторым методом при наличии у сперматозоида множественных патологий фиксировали каждую аномалию отдельно, относя такие клетки к нескольким морфологическим типам. В данном случае сумма частот всех типов аномалий, морфологически нормальных и пограничных сперматозоидов может превышать 100%. Подсчитывали также и долю сперматозоидов с сочетанной патологией. Такой подход дает возможность проанализировать частоту встречаемости всех типов аномалий, позволяя в каждом конкретном случае составить более объективное представление о спектре морфологических патологий, характерном для популяции сперматозоидов.
 |
| Рис. 1. Схема классификации морфологии сперматозоидов. |
Относительное (в процентах от исходной величины) изменение частот встречаемости различных морфологических типов сперматозоидов рассчитывали по формуле:
где А0- частота встречаемости клеток определенного типа в нативном эякуляте, А1 - соответствующее значение для фракции прогрессивно подвижных сперматозоидов.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием методов корреляционного и множественного регрессионного анализа, а также td - критерия Стьюдента для совокупностей с попарно связанными вариантами.
Далее...
Написать комментарий
|
