|
Аксенов О.А., Платонова Г.А., Тимковский А.Л. НИИ детских болезней РАМН, Санкт-Петербург; Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург; Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина, Ленинградская обл.
В начало...
Установлено, что при модификации цис-диаммин-дихлор-Pt(II) (цис-ДДП) противогриппозная защитная активность in vivo поли(А)?поли(У), в отличие от поли(Г)?поли(Ц) и поли(И)?поли(Ц), монотонно возрастает с повышением степени модификации (rb) в исследованном интервале от 0 до 0,2. Параллельно наблюдается рост титров интерферона в мозгу мышей. Предполагается, что основой наблюдаемого явления является структурная специфика данного дуплекса и что связывание лиганда в N(7)-положении гетероциклов аденина предотвращает образование хугстиновских пар аденина с урацилом и повышает эффективную длину регулярных двунитевых участков поли(А)?поли(У), обеспечивающих его биологическую активность.Ключевые слова:
Со времени открытия интерферон-индуцирующей активности комплексов (дуплексов) синтетических полирибонуклеотидов поли(А)?поли(У) относится к числу наиболее детально исследованных. В большинстве модельных систем, в особенности в опытах in vivo, его активность существенно ниже, чем у поли(И)?поли(Ц) [1]. Однако токсичность этого дуплекса очень невысока, и это дало основания для его клинического изучения и применения как противовирусного и противоопухолевого препарата, в том числе в нашей стране - под названием "Полудан" при герпетических инфекциях глаз [2]. Имеются также основания считать поли(А)?поли(У) перспективным анти-ВИЧ препаратом [3]. Известны успешные попытки повышения активности (термоактивации) комплексов, содержащих комплементарные пары нуклеотидов А?У, но они давали наилучший эффект не для дуплекса гомополимеров поли(А)?поли(У), а для регулярного сополимера поли(А-У), складывающегося в двунитевую шпильку [4]. Ранее нами было исследовано влияние пуринспецифичных соединений двухвалентной платины, в том числе обладающей противоопухолевой активностью цис-диаммин-дихлор-Pt(II) (цис-ДДП), на стабильность и биологическую активность дуплекса поли(Г)?поли(Ц) [5, 6]. Подобные модификации поли(А)?-поли(У) до настоящего времени не рассматривались.
В данной работе мы изучили зависимость биологической активности дуплексов поли (А)?поли(У) от степени их модификации цис-ДДП. Предложено объяснение полученных результатов на основании представлений о структурной организации полинуклеотидных индукторов интерферона.
Полирибонуклеотиды поли (А) и поли (У) - коммерческие препараты фирмы "Reanal" (Венгрия) подвергали дополнительной очистке интенсивным диализом и спиртовым переосаждением, при необходимости проводили фенольную депротеинизацию; высокомолекулярную фракцию полимеров отделяли с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-75 [7]. Дуплексы поли(А)?поли(У) готовили смешением растворов поли(А) и поли (У) в эквимолярном соотношении в присутствии 0,005 М Na-фосфатного буфера, рН 7,5, и 0,1 М NaCl и инкубацией смесей при 37 ?С в течение 2 ч с последующей регистрацией спектральных изменений (гипохромия в области 260 нм) на спектрофотометрах "Specord UV VIS" ("Carl Zeiss Jena", Германия) или DU-25 ("Beckman", США). Согласно литературным данным, примененные условия обеспечивают смещение равновесия в сторону образования двунитевых комплексов (дуплексов) и сводят к минимуму вероятность формирования трехнитевых комплексов [8]. Приготовленные дуплексы стандартизовали по критериям, разработанным ранее для поли-(Г)?поли(Ц) и поли(И)?поли(Ц) [7].
Использовали цис-ДДП фирмы "LACHEMA" (Брно, Чехия). Предназначенные для модификации препараты подвергали интенсивному диализу против 0,01 М NaClO4, pH 7,0. Взаимодействие поли(А)?поли(У) с цис-ДДП осуществляли в 0,01 М NaClO4, pH 7,0, в режиме, обеспечивавшем количественное связывание лиганда с полинуклеотидным дуплексом [6]. Степень модификации характеризовали величиной rb, представляющей собой среднее количество связанных атомов Pt(II) на 1 нуклеотидный остаток.
Биологическую активность нативных дуплексов определяли в организме беспородных белых мышей весом 20 г. Активность модифицированных дуплексов и зависимость активности от степени модификации определяли в опытах на молодых мышах весом 10-12 г. Для определения противовирусной активности препараты в дозе 20 мкг/мышь вводили интраназально за 24 ч до заражения летальной дозой вируса гриппа АО/PR8 и затем регистрировали гибель животных в различные сроки после заражения. Для измерения интерферон-индуцирющей активности препараты вводили в хвостовую вену в дозе 100 мкг/мышь; в различные сроки после инъекции животных забивали и титровали интерферон порознь в гомогенатах легких и мозга методом количественной гемадсорбции [7]. В начальных экспериментах в качестве контроля использовали дуплекс поли(И)?поли(Ц) фирмы "Calbiochem" (Швейцария) и приготовленный нами дуплекс поли(Г)?поли(Ц).
В табл. 1 приведена выживаемость мышей, инфицированных 100 LD50 вируса гриппа и защищенных предварительным введением поли-(И)?поли(Ц), поли(Г)?поли(Ц) и высокомолекулярного поли(А)?поли(У), приготовленного из очищенных поли(А) и поли(У). Дуплексы поли-(И)?поли(Ц) и поли(Г)?поли(Ц) по активности были практически идентичны, тогда как противовирусная активность поли(А)?поли(У) была существенно ниже, хотя по молекулярным характеристикам он соответствовал разработанным нами стандартам для другого нуклеотидного состава [7]. Это соответствует известным литературным данным [1].
| Таблица 1. Сравнение противовирусной активности полирибонуклеотидных дуплексов поли(А)?поли(У), поли(Г)?поли(Ц) и поли(И)?поли(Ц) |
| Препарат |
Выживаемость мышей после заражения 100 LD50 вируса гриппа АO/PR8 (в сутках) |
Kумулятивная выживаемость, % |
р |
| 6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
| Поли(А)?поли(У) |
15/15 |
13/15 |
10/15 |
4/15 |
3/15 |
60,0 |
<0,01 |
| Поли(Г)?поли(Ц) |
14/14 |
14/14 |
13/14 |
10/14 |
6/14 |
81,4 |
>0,05 |
| Поли(И)?поли(Ц) |
15/15 |
15/15 |
14/15 |
11/15 |
7/15 |
82,7 |
- |
| Плацебо |
9/13 |
0/13 |
0/13 |
0/13 |
0/13 |
15,4 |
- |
Примечания. 1. Препараты вводили интраназально в дозе 20 мкг/мышь за сутки до заражения вирусом гриппа. 2. Выживаемость представлена дробью, числитель которой - число выживших на данные сутки мышей, а знаменатель - общее число мышей в группе; для расчета кумулятивной выживаемости оба показателя суммируются за несколько выбранных суток для каждой группы мышей, и первая сумма делится на вторую. 3. Уровень значимости р рассчитан для кумулятивной выживаемости при введении поли(А)?поли(У) и поли(Г)?поли(Ц) в сравнении с выживаемостью при введении поли(И)?поли(Ц).
Далее...
Написать комментарий
|
