Микробные ингибиторы ферментов биосинтеза и этерификации холестерина

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N5, стр. 38-44.

В начало...

При скрининге микромицетов на наличие у них ингибиторов биосинтеза холестерина могут быть использованы дрожжи.

Дрожжи - одноклеточные представители эукариот, основным стерином которых является эргостерин, - простая модель для изучения действия ингибиторов биосинтеза холестерина.

Детальное изучение влияния ловастатина на рост дрожжей, относящихся к родам Rhodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces и Lipomyces показало, что наиболее чувствительны к этому ингибитору красные дрожжи родов Rhodotorula и Sporobolomyсes. Чувствительность различных штаммов одного вида к ловастатину значительно варьирует, что может быть обусловлено различным содержанием стеринов в клетках дрожжей [23, 24].

Минимальная ингибирующая рост дрожжей концентрация ловастатина для штамма Rh.rubra ВКПМ Y1337 составляет 0,1 мкг/мл. Пропорциональная зависимость ингибирования роста Rh.rubra от концентрации ловастатина в среде наблюдается в пределах от 0,1 до 0,5 мкг ингибитора на 1 мл среды. При концентрации ингибитора 1 мкг/мл и выше рост дрожжей полностью подавлен.

Характер ингибирования ферментов биосинтеза эргостерина у дрожжей на средах с ловастатином иной по сравнению с характером ингибирования роста. Снижение уровня эргостерина в клетках дрожжей наблюдается в период до стационарной фазы их развития, а в дальнейшем происходит постепенное увеличение количества эргостерина. Увеличение количества эргостерина в клетках дрожжей при длительном их инкубировании с ингибитором может быть обусловлено индукцией синтеза ГМГ-КоА-редуктазы под действием ловастатина [25].

Индукцию ГМГ-КоА-редуктазы наблюдали при инкубировании фибробластов человека с компактином (ML-236B) [7].

Показано, что биотрансформация предшественников ловастатина в бесклеточных экстрактах М.ruber происходит при участии цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ [19]. Цитохром Р-450-зависимые оксигеназы участвуют также в биосинтезе стеринов и, в частности, холестерина. Известно, что субстраты цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ являются индукторами этих ферментов. Поэтому закономерно, что при некоторых условиях ловастатин, а также его аналоги могут выступать в качестве индукторов ряда ферментов биосинтеза стеринов (эргостерина и холестерина).

Корреляционная связь между активностью ингибиторов и их структурой в настоящее время уже достаточно хорошо изучена. Сравнение ингибиторной активности аналогов компактина и ловастатина показало, что максимальной активностью обладают монаколин К и ингибитор ML-236B, что указывает на существенную роль 2-метилбутирата в ингибиторной активности [26]. Показано, что высокая биологическая активность синтетических аналогов компактина и ловастатина в большой степени обусловлена полярностью боковой цепи ингибитора и распределением заряда в этой области молекулы [27].

В результате модификации природных ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы получен ряд новых, часто более активных ингибиторов редуктазы. Так, химической модификацией ловастатина получен новый ингибитор симвастатин (МК-733) (рис. 3), а в результате биологической трансформации компактина гидроксилазной системой Streptomyces carbophilus получен высокоактивный ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы правастатин (CS-514) (рис. 4).

Рис. 3. Химическая структура симвастатина (МК-733).	Рис. 4. Химическая структура правастатина (СS-514).
Рис. 5. Химическая структура паннорина.	Рис. 6. Химическая структура антибиотика 1233А.

Производные ловастатина и компактина, полученные путем химической модификации, в ряде случаев имеют ингибиторную активность в 2,5-6 раз более высокую, чем у природного ингибитора [28].

Среди продуктов жизнедеятельности мицелиальных грибов обнаружен ряд веществ с различной химической структурой, но одинаковой биологической активностью. Некоторые из этих соединений ингибируют ГМГ-КоА-редуктазу.

Некоторые из них были известны ранее. Так, феницин - антибиотическое вещество, образуемое Peniсillium pheoniсeum и Р.rubrum, описано еще в 1933 году. Изучение биологической активности феницина показало, что антибиотик ингибирует ГМГ-КоА-редуктазу [29]. Феницин ингибирует на 50% биосинтез стерола из ¹⁴C-ацетата в концентрации 30 мкМ и на 50% активность ГМГ-КоА-редуктазы в микросомах печени крыс в концентрации 200 мкМ. Показано, что ингибирование феницином ГМГ-КоА-редуктазы обусловлено его взаимодействием с SH-группами фермента.

Другое соединение - цитринин, токсичное вещество из Р.citrinum, действует преимущественно на грамположительные бактерии, проявляет антипротозойную активность и также способно ингибировать ГМГ-КоА-редуктазу. Цитринин ингибирует синтез стеринов в бесклеточной системе печени крыс и дрожжей, специфически ингибируя ферменты ацетоацетил-КоА-тиолазу и ГМГ-КоА-редуктазу. Концентрация, необходимая для ингибирования на 50%, составляет 0,2 мМ для первого фермента и 0,5 мМ для второго. При работе с бесклеточными системами дрожжей требуются более высокие концентрации цитринина [30, 31].

В 1991 г. японские авторы сообщили о выделении из культуральной жидкости гриба Chrysosporium pannorum M 10539 нафтопирена паннорина (рис. 5) [32]. Паннорин был выделен из культуральной жидкости продуцента экстракцией растворителем с последующей хроматографией на колонке с биогелем Р-6, а затем при помощи ВЭЖХ. Паннорин ингибирует ГМГ-КоА-редуктазу и биосинтез стеролов in vitro на 50% в концентрации 160 мкМ. Ингибитор имеет максимумы поглощения в метаноле при 230, 252, 275 и 288 нм.

В результате изучения физиологически активных соединений у мицелиальных грибов было обнаружено, что грибы Sсopulariopsis sp. и Fusarium sр. образуют антибиотик 1233А. Этот антибиотик является -лактоном и подавляет рост Candida albicans, Penicillium nerguei, Pyricularia oryzae и Staphylococcus aureus. Впервые это соединение было выделено из гриба Cephalosporium sр. (рис. 6). [33]. Было показано, что в ферментативной системе печени крыс антибиотик 1233А ингибирует включение меченого ацетата, но не мевалоната в неомыляемую фракцию липидов. Включение ¹⁴C-ацетата в холестерин ингибируется антибиотиком на 50% в концентрации 0,58 мкг/мл.

Изучение действия антибиотика 1233А на ферменты, участвующие в биосинтезе мевалоната: ГМГ-КоА-синтазу, ГМГ-КоА-редуктазу и ацетоацетил-КоА-тиолазу, показало, что это вещество ингибирует ГМГ-КоА-синтазу, фермент, осуществляющий реакцию образования оксиметилглутарил-КоА из ацетоацетил-КоА и ацетил-КоА. Как было установлено для антибиотика 1233А, величина КИ₅₀ с ГМГ-КоА-синтазой составляет 0,032-0,065 мкг/мл [34].

Образуется антибиотик 1233А при выращивании продуцента в условиях аэрации при 27?С в течение 10-11 дней на среде следующего состава (в %): глицерин - 3,0; глюкоза - 1,0; пептон - 0,3; NaCl - 0,2; цеолит - 1,0; агар-агар - 0,1, рН среды 7,0 [34, 35, 36].

В 1992 г. появилось сообщение об открытии трех структурно новых ингибиторов другого фермента биосинтеза холестерина-скваленсинтазы. Эти ингибиторы, названные сквалестатинами, продуцируются грибом Phoma sр. С2932 (рис. 7) [37, 38]. Показано, что они ингибируют сквален-синтазу у животных (в печени крыс) и у грибов (Candida albiсans) (КИ₅₀ = 5 нМ); кроме того, эти соединения обладают широким спектром антимикробной активности.

Рис. 7. Химическая структура сквалестатинов.

Скваленсинтаза (КФ 2.5.1.21) катализирует первую специфическую реакцию на пути биосинтеза стеролов. Продуцент выращивали в среде, содержащей (в г/л): глицерин - 50; соевое масло - 30; порошок из семян хлопчатника - 10, дистиллированную воду, рН 6,1-6,3. Культивирование проводили в аэробных условиях (250 об/мин) в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл и содержащих 50 мл среды. В этих условиях сквалестатины обнаруживались в культуральной жидкости на 4-е сутки культивирования гриба, и количество ингибиторов постоянно увеличивалось в течение ферментации.

Сквалестатины были выделены с помощью метода противоточной хроматографии. Максимум поглощения в УФ-свете компонентов 1 и 2 отмечен при 210 и 211 нм соответственно.

Среди продуктов метаболизма грибов pода Peniсillium обнаружены ингибиторы грибной Р-450 ланостерол С14-деметилазы [39, 40]. Ряд антигрибных антибиотиков, способных ингибировать этот фермент, выделен из культуральной жидкости гриба Penicillium sр. NR 6564. Все они представляют собой производные тетрагидропирана с алкенильной жирной цепью (рис. 8). Всего выделено семь родственных компонентов: Ro09-1469, Ro09-1470, Ro09-1543, Ro09-1545, Ro09-1547, Ro09-1549 и Ro09-1544. Структурные различия этих компонентов представлены на рис. 8. Найдено, что ингибитор Ro09-1469 образуется также некоторыми штаммами Aspergillus sсlerotiorum.

Рис. 8. Химическая структура ингибиторов Р-450 ланостерол С14-деметилазы.

Для получения ингибиторов Р-450 ланостерол C14-деметилазы продуцент Penicillium sр. NR 6564 выращивают в среде, содержащей (в %): глюкозу - 2,0; глицерин - 3,0; полипептон - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,2; NaСl - 0,3; CaCO₃ - 1,0. Культивирование проводят в 50-литровом ферментере при 27?С с аэрацией (30 л/мин). Количество Ro09-1470 в фильтрате увеличивается параллельно с ростом, достигая через 96 ч концентрации 28 мг/л. Потенциальную активность ингибиторов определяют по антигрибной активности с Candida albiсans 652 [40]. Выделение активных компонентов проводят с помощью экстракции этилацетатом и разделения их между водной фазой и н-гексаном при рН 2. Гексановый слой содержит нейтральные компоненты Ro09-1469, Ro09-1543, Ro09-1547, Ro09-1549 и Ro09-1544, тогда как в водном слое обнаруживаются основные компоненты Ro09-1470 и Ro09-1545. Нейтральные компоненты выделяют колоночной хроматографией на силикагеле с последующим разделением на сефадексе LH-20 и препаративной ВЭЖХ. Компоненты из водного слоя также делят на фракции с помощью колоночной хроматографии. Детали выделения и очистки ингибиторов Р-450 ланостерол С14-деметилазы из Peniсillium sр. NR 6564 изложены в статье Матсукумы и соавторов [40]. Все выделенные компоненты крайне не стабильны, и их хранят в атмосфере аргона.

Eще одна группа ингибиторов биосинтеза холестерина выделена из фильтратa культуральной жидкости гриба Penicillium simplicissimum FН-А 6090. Эти ингибиторы названы декарестриктинами и представляют собой 10-членные лактоны (рис. 9) [41,42].

Рис. 9. Химическая структура декарестриктинов.

Штамм P.simplicissimum FH-A 6090 выращивают в среде, содержащей (в %): солодовый экстракт - 2; дрожжевой экстракт - 0,2; глюкозу - 1,0; (NH₄)₂HPO₄ - 0,03; рН 6,0.

Культивирование проводят в ферментере при 25?С и аэрации (5,0 л/мин) в течение 8 дней.

Выделяют декарестриктины из фильтрата культуральной жидкости продуцента путем абсорбции на Амберлите XAD-16 и элюции смесью метанол-вода (4:1) с последующим концентрированием в вакууме и лиофилизацией остатка. Затем остаток экстрагируют этилацетатом, и полученный экстракт хроматографируют на колонке с силикагелем (элюция - градиентом метанола 0-60% в этилацетате). Всего выделено девять декарестриктинов (от Е до М). Очистку каждого компонента проводят колоночной хроматографией в различных системах органических растворителей (дихлорэтан, н-гексан, ацетон, метанол) и хроматографией на сефадексе LH-20, используя метанол как элюент [41].

Декарестриктины ингибируют включение ¹⁴C-ацетата в стерины культуры клеток HEP-G2 печени. Степень ингибирования биосинтеза холестерина зависит от структуры декарестриктина. Наибольшей ингибиторной активностью, оцениваемой по включению ¹⁴C-ацетата в холестерин клеток печени HEP-G2, обладают декарестриктины D и М [41, 43].

Далее...