Микробные ингибиторы ферментов биосинтеза и этерификации холестерина

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N5, стр. 38-44.

В начало...

Настоящий обзор посвящен вопросам образования ингибиторов ферментов, участвующих в биосинтезе холестерина, микроорганизмами, преимущественно мицелиальными грибами.

Рассмотрено образование ингибиторов ферментов начальных этапов биосинтеза холестерина - 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-синтазы и 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы; ингибитора первой специфической стадии в биосинтезе холестерина - скваленсинтазы, а также ингибитора фермента Р-450 ланостерол С14-деметилазы, участвующего в конечных этапах биосинтеза холестерина.

Приведены данные о продуцентах, условиях ферментации, структуре ингибиторов и их биологической активности.

Рассмотрена возможность использования дрожжей в качестве модели для выявления ингибиторов и изучения их действия на клетки эукариот.

В обзоре приведены также данные о продуцентах и биологической активности образуемых ими ингибиторов фермента этерификации холестерина - ацил-КоА-холестерин-ацилтрансферазы (АХАТ).

Среди продуктов метаболизма мицелиальных грибов были обнаружены вещества с антигрибной активностью, механизм действия которых заключался в ингибировании ферментов, участвующих в биосинтезе стеринов, в частности холестерина.

Холестерин - это основной стерин в клетках животных и человека, который входит в состав клеточных мембран, а также является предшественником желчных кислот и стероидных гормонов. Нарушение обмена холестерина в организме человека приводит к такому тяжелому заболеванию, как атеросклероз.

К настоящему времени путь биосинтеза стеринов достаточно хорошо изучен. Стерины синтезируются из ацетил-КоА с участием многих ферментов. Путь биосинтеза стеринов условно можно разбить на три стадии (схема).

Схема биосинтеза холестерина.

Первая стадия включает образование ацетоацетил-КоА при участии фермента ацетоацетил-КоА-тиолазы (КФ 2.3.1.9.). Затем ацетоацетил-КоА взаимодействует с ацетил-КоА с образованием 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА (ГМГ-КоА). Реакция образования ГМГ-КоА катализируется ГМГ-КоА-синтазой (КФ 4.1.3.5.). ГМГ-КоА восстанавливается до мевалоновой кислоты ГМГ-КоА-редуктазой (КФ 1.1.1.34).

Мевалонат - ключевое соединение для синтеза изопреноидов. Эта реакция определяет скорость биосинтеза холестерина в клетках животных и человека.

Следующая стадия биосинтеза холестерина включает ряд промежуточных реакций, которые приводят к образованию активного изопрена и его последовательной конденсации в сквален.

Третья стадия связана с превращением сквалена в холестерин. Происходит циклизация сквалена в ланостерин - первый циклический промежуточный продукт на пути биосинтеза холестерина. Дальнейшее превращение ланостерина в холестерин включает не менее 25 этапов. Происходит насыщение двойных связей и деметилирование при С4 и С14. Конечные этапы биосинтеза холестерина происходят с участием ферментов, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума [1-3].

В настоящее время среди продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, в основном мицелиальных грибов, обнаружен ряд веществ, ингибирующих активность ферментов биосинтеза стеринов.

Наибольший интерес среди этих соединений представляют ингибиторы ключевого фермента биосинтеза холестерина - 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы). На основе некоторых ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы созданы препараты, применяемые в медицине для лечения и профилактики атеросклероза.

Широкое распространение ингибиторов ферментов биосинтеза стеринов среди мицелиальных грибов обусловлено особенностями их обмена, а именно - наличием у них пути биосинтеза изопреноидных соединений. Многие ингибиторы синтезируются грибами из ацетатных единиц на пути биосинтеза изопреноидов.

Первым из грибных ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы был описан ингибитор ML-236В, выделенный из фильтрата культуральной жидкости Penicillium citrinum 18767 [4, 5]. Наряду с МL-236В P.citrinum образует ингибиторы ML-236A и МL-236C. Структурные различия этих компонентов представлены на рис. 1.

Рис. 1. Химическая структура компактина (ML-236B) и его аналогов.	Рис. 2. Химическая структура монаколина К (ловастатина) и его аналогов.

P.citrinum 18767 выращивали в аэробных условиях в течение 4-х суток в среде, содержащей в %: солодовый экстракт - 3,0, глюкозу - 2,0, пептон - 0,1.

Выделение ингибиторов было проведено путем экстракции из подкисленной культуральной жидкости этилацетатом. Экстракты после концентрирования под вакуумом наносили на колонку с силикагелем в н-гексане. ML-236C элюировали с колонки смесью н-гексан-ацетон (95:5), ML-236B - смесью н-гексан-ацетон (85:15) и ML-236A - чистым ацетоном. Как было установлено, все выделенные вещества ингибируют активность ГМГ-КоА-редуктазы, максимальной активностью обладал ML-236B.

В результате гидролиза лактонных форм ингибиторов получают соответствующие гидроксикислоты или их соли, ингибиторный эффект которых значительно выше, чем лактонных форм.

Соединение, идентичное ингибитору ML-236B и выделенное из P.breviсompaсtum, было названо компактином [6].

Компактин ингибирует микросомальную редуктазу из печени крыс, включение ¹⁴C-ацетата в холестерин в гомогенатах печени крыс, а также конкурентно ингибирует ГМГ-КоА-редуктазу в фибробластах чeлoвeкa. Концентрация ингибитора, требуемая для 50% ингибирования ГМГ-КоА-редуктазы (КИ₅₀), составила 1,1 нМ. Скорость включения ¹⁴C-ацетата в холестерин ингибируется компактином в концентрации 0,2 мкМ более чем на 80% [7].

Ингибиторную активность определяют по включению ¹⁴C-ацетата в неомыляемую фракцию липидов в ферментной системе печени крыс [8].

Активность ГМГ-КоА-редуктазы оценивают по скорости превращения 3-гидрокси-3-метил-¹⁴C-глутарил-КоА в ¹⁴C-мевалонат и выражают в пикомолях мевалоната, образуемого в 1 мин на 1 мг солюбилизированного белка [9].

Кроме того, активность ГМГ-КоА-редуктазы определяют спектрофотометрическим методом по скорости окисления НАДФН в НАДФ в процессе восстановления ГМГ-КоА в мевалонат. В этом случае инкубационная смесь (0,1 мл 50 мМ К-фосфатного буфера, рН 7,4) содержит: 2 мкМ глюкозо-6-фосфат; 0,25 мкМ НАДФН; 0,5 мкМ дитиотриэтол; 0,003 мкМ ГМГ-КоА; 0,07 ед. глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и 100 мкг белка [10].

В 1979 году впервые из экстрактов гриба Aspergillus terreus ATCC 20542 было выделено вещество монаколин К (мевинолин, ловастатин) - конкурентный ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы [11]. Это вещество представляет собой [1S-[l(R),3,7,8(2S,4S)8а]]-1,2,3,7,8,8а-гексагидро-3,7-диметил-8[2-(тетрагидро-4-гидрокси-6-oксо-2Н-пиран-2-ил)этил]-1-нафтил-2-метилбутират и относится к группе лактонов гексагидронафталина (рис. 2).

На основе ловастатина был создан препарат "мевакор", используемый для профилактики и лечения атеросклероза.

Ингибирование ГМГ-КоА-редуктазы ловастатином уменьшает содержание холестерина в клетках, что приводит к увеличению числа рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛНП) и к возрастанию выведения ЛНП из кровотока. Такой эффект наблюдается как у пациентов с гетерозиготной формой семейной гиперхолестеринемии, так и у пациентов с ненаследственной первичной гиперхолестеринемией [12, 13].

Положительным фактором при использовании ловастатина является блокирование биосинтеза холестерина на ранних стадиях, что исключает накопление токсичных стеролов.

С целью получения ловастатина A.terreus выращивают в среде, содержащей (в %): глюкозу - 4,5; пептонизированное молоко - 2,4; дрожжевой экстракт - 0,25; полиэтиленгликоль (Р 2000) - 0,25 мл/100 мл среды, рН 7,4. Культивирование проводят в течение 4-6 суток при 28?С.

Изучение образования мевинолиновой кислоты микромицетом A.terreus ATCC 20542 показало, что в среде, содержащей 45 г глюкозы, 24 г пептонизированного молока, 2,5 г дрожжевого экстракта в 1 л среды, при выращивании на качалке в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл и содержащих 40 мл среды при сильной аэрации (365 об/мин) максимум образования ингибитора происходит на 3-5-е сутки культивирования.

Показано также, что ¹⁴C-ацетат и ¹⁴C-метионин являются предшественниками мевинолиновой кислоты и включаются как в боковую жирную цепь молекулы ингибитора (2-метилбутират), так и в основную спиртовую часть молекулы [14]. Другим продуцентом монаколина К (ловастатина) является гриб Monasсus ruber [15,16]. Monascus ruber N 1005 выращивали в среде, содержащей (в %): глюкозу - 6,0; пептон - 2,5; кукурузный экстракт - 0,5; NH4Cl - 0,5, в аэробных условиях при 25?C в течение 10 дней.

Ингибитор выделяют из фильтрата культуральной жидкости путем экстракции этилацетатом, хроматографией на колонке с силикагелем и последующей ВЭЖХ, как описано в работе Эндо с сотрудниками [17].

Помимо монаколина К гриб M.ruber образует еще два родственных компонента - монаколин J и монаколин L (см. рис. 2) [18]. Максимумы поглощения в УФ-спектре маколина L - 230, 237 и 247 нм такие же, как у монаколина J и монаколина К. Величина КИ₅₀ составила 1,2 и 0,94 мкг/мл для Na солей монаколина J и L соответственно. При тех же условиях КИ₅₀ составляло 0,38 и 0,69 мкг/мл для Na солей монаколина К и ML-236B (компактина) соответственно.

Превращение монаколина L в J наблюдали в бесклеточных экстрактах у M.ruber М 4681. Реакцию гидроксилирования осуществляла монооксигеназа, локализованная в микросомальной фракции и специфичная к НАДФН.

Выращивание M.ruber с ¹⁴C-монаколином L и J показало, что оба компонента являются предшественниками монаколина К [19].

Из исследованных на способность образовывать монаколин К (мевинолин) 124 штаммов Моnascus, относящихся к 18 видам и 1 подвиду, активными оказались 17 штаммов (5 видов). Это были штаммы M.ruber, M.pilasus, М.purpureus, М.vitreus и M.pubigerus. Характерной особенностью всех активных штаммов было образование красного пигмента [20].

Способность образовывать компактин и ловастатин (монаколин К), как оказалось, широко распространена среди мицелиальных грибов - представителей различных родов.

Изучение японскими исследователями 4000 вновь выделенных штаммов грибов из почвенных образцов, хранящихся в университете г. Токио, и 1677 штаммов, полученных из Institute for Fermentation г.Осака (IFO), на способность образовывать ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы - компактин и ловастатин - позволило выявить новые продуценты этих ингибиторов.

Исследуемые штаммы грибов выращивали в среде, содержащей (в %): глюкозу - 3,5; крахмал - 1,0; соевую муку- 2,0; мясной экстракт - 0,5; пептон - 0,5; NaCl - 0,2; КН₂РО₄ - 0,05; MgSO₄?7H₂O - 0,05, pH 5,8, в аэробных условиях при 25?С в течение 7 дней.

Ингибиторную активность определяли по включению ¹⁴C-ацетата в холестерин ферментными системами печени крыс [21].

В результате проведенных исследований два штамма, продуценты ловастатина, были идентифицированы как Monascus ruber М 4681 и Aspergillus terreus M 4865. Кроме того, продуценты ловастатина выявлены среди грибов pодов Phoma, Doratomyсes и Gymnoascus. Продуценты компактина были обнаружены среди представителей родов Trichoderma, Нуроmуcеs, Eupenicillium и Paecilomyces. Количество образуемых ингибиторов в описанных условиях культивирования грибов варьирует в пределах 0,1-3,0 мкг/мл. Значительно больше компактина, согласно данным названных авторов, образует штамм Paecilomyces sр. М 2016 - 49,6 мкг/мл (табл. 1).

Таблица 1. Штаммы грибов, образующие компактин и ловастатин [21]
Штамм	Продуктивность, мкг/мл
	компактин	ловастатин
Paeсilomyсes sр. М 2016	49,6	-
Eupenicillium sр. M 6602	~1	-
Trichoderma longibrachiatum M 6735	1,5	-
Trichoderma pseudokoningii M 6828	1,5	-
Hypomyces chrysosporium IFO 7790	2,7	-
Phoma sр. M 4452	-	1,7
Doratomyces nanus IFO 9551	-	~0,1
Gymnoascus ambrineus IFО 8450	-	~0,1

Способность образовывать мевинолин (ловастатин) обнаружена также у грибов рода Рleurotus. Мевинолин образуют грибы P.sapidus, P.saca и P.ostreatus. Идентичность ингибиторов была подтверждена авторами методами ТСХ, ВЭЖХ и масс-спектроскопией. Исследование было проведено с солюбилизированной микросомальной ГМГ-КоА-редуктазой из клеток яичника китайского хомячка [22].

Далее...