Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам

Государственный научный центр прикладной микробиологии, п. Оболенск, Московская обл.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N4, стр. 39-43.

В начало...

Другой стороной проблемы туберкулеза является развитие у ее возбудителя - Mycobacterium tuberculosis и других микобактерий туберкулезного комплекса лекарственной устойчивости. Поток сообщений о выявлении у больных туберкулезом микобактерий, устойчивых к одному, двум или нескольким противотуберкулезным препаратам, постоянно нарастает. Анализ данных литературы свидетельствует о распространении лекарственноустойчивых штаммов возбудителя туберкулеза практически во всем мире. По мнению американских исследователей [1, 2], в США было уже несколько эпидемий туберкулеза, вызванных множественноустойчивыми штаммами M.tuberculosis. Совершенно очевидно, что это является серьезным препятствием для химиотерапии туберкулеза, которой отводится основное место в борьбе с этим заболеванием.

Результаты многочисленных исследований, посвященных устойчивости M.tuberculosis к лекарственным препаратам, свидетельствуют о том, что лежащие в ее основе молекулярные механизмы принципиально не отличаются от уже известных для большинства других бактерий [3-5].

Развитие устойчивости у M.tuberculosis к ряду противотуберкулезных препаратов показывает, что уровень устойчивости бактериальной культуры находится в зависимости от концентрации используемого для лечения препарата. При повышении последней повышается и уровень устойчивости бактериальной культуры. Сходная картина наблюдается при монотерапии инфекции с последовательной сменой препаратов при неэффективном лечении. В результате можно отобрать штамм микроба, у которого последовательно развилась устойчивость к нескольким препаратам. Это объясняет возникновение устойчивых к одному препарату и множественноустойчивых штаммов в клинической практике [6, 7]. Скорость развития устойчивости коррелирует с частотой возникновения в бактериальной хромосоме мутаций, обусловливающих устойчивость к тому или иному лекарственному средству. В конечном же итоге появление лекарственноустойчивых штаммов M.tuberculosis определяется эффективностью селекции мутантов бактерий, обладающих определенным уровнем устойчивости к тому или иному антимикробному препарату. Частота появления мутантов с лекарственной устойчивостью различна и колеблется от 10^-6 для рифампицина и изониазида, 10^-8 для стрептомицина и до 10^-9 - для препаратов группы фторхинолонов [8, 9].

Таким образом, вероятность возникновения и отбора устойчивых штаммов в больших популяциях микобактерий достаточно высока. В легочных кавернах диаметром 2,5 см обнаруживают около 10⁸ бактерий возбудителя туберкулеза, следовательно, в такой каверне может содержаться примерно 10² клеток, устойчивых к изониазиду. При селективном давлении изониазида (при лечении) устойчивые к этому препарату микобактерии имеют возможность беспрепятственно размножаться. Очевидно, аналогичная ситуация накопления лекарственноустойчивых мутантов M.tuberculosis в организме больного туберкулезом возможна и в случае применения других антимикробных препаратов. Различия заключаются лишь в молекулярных механизмах возникновения устойчивости. Накопленные к настоящему времени данные о природе лекарственной устойчивости M.tuberculosis представлены в табл. 1.

Таблица 1. Механизмы действия противотуберкулезных препаратов и лекарственной устойчивости к ним M.tuberculosis
Антимикробный препарат	Механизм действия	Гены, ответственные за устойчивость	Вероятность встречаемости мутантов, %	Механизм устойчивости
Изониазид	Ингибирование синтеза миколовой кислоты	1) katG (каталаза-пероксидаза)	47-58	1) Мутации в гене katG приводят к потере активности интермедиатов изониазида.
		2) inhA (енол-АСР-редуктаза)	21-34	2) Суперэкспрессия гена inhA обеспечивает продолжение синтеза миколовой кислоты и вызывает инактивацию активного интермедиата изониазида.
		3) ahpC (алкил-гидропероксид-редуктаза)	10-15	3) Мутации в гене ahpC способствуют детоксикации активного интермедиата изониазида
Рифампицин	Ингибирование ДНK-зависимой РНK-полимеразы	rpoB (-субъединица РНK-полимеразы)	96-98	Мутации приводят к снижению способности фермента связываться с рифампицином
Стрептомицин	Ингибирование синтеза белка	1) rpsL (рибосомный белок S12)	52-59	Мутации приводят к изменению структуры рибосом и снижению проницаемости внешних структур микробной клетки
		2) rrs (16S рРНK)	8-21
Этамбутол	Ингибирование биосинтеза арабиногалактана и липоарабиноманнана	embAB (арабинозил-трансфераза)	50	Высокий уровень экспрессии или мутация в гене embAB делает возможным продолжение синтеза арабина
Пиразинамид	Не известен	pcnA	Не известен	Потеря активности пиразинамидазы нарушает процесс превращения пиразинамида в пиразиновую кислоту
Фторхинолоны	Ингибирование ДНK-гиразы (топоизомеразы IV)	gyrA (субъединица А ДНK-гиразы)	75-94	Снижение аффинности фермента к препаратам фторхинолоновой группы

Устойчивость к изониазиду. M.tuberculosis и M.bovis высокочувствительны к изониазиду. Препарат оказывает подавляющий эффект на клетки этих микроорганизмов в концентрации 0,02 мкг/мл. Остальные виды микобактерий менее чувствительны к изониазиду. Для их подавления требуется концентрация препарата от 1 до 10 мкг/мл. Имеется огромное количество информации, как в области генетики, так и биохимии, о многоступенчатости процесса активации изониазида, превращении его в активное производное, способное ингибировать синтез миколовой кислоты. Клетки M.tuberculosis поглощают изониазид, где происходит его окисление с помощью каталазы-пероксидазы и превращение в активный промежуточный продукт, который оказывает губительное действие на клетку. Долгое время отсутствие каталазной активности рассматривалось только в качестве маркера устойчивости к изониазиду [10, 11]. Недавно установлено, что эта корреляция является результатом мутации в гене katG, кодирующем синтез каталазы-пероксидазы [12, 13]. Это явление наблюдается приблизительно у 50% клинических штаммов (см. табл. 1).

В присутствии интактной каталазы-пероксидазы генерируется активный агент, который подавляет работу фермента, участвующего в синтезе миколовой кислоты - енол-кислой фосфатредуктазы, кодируемой геном inhA [14, 15]. По-видимому, мутации в гене inhA являются причиной устойчивости к изониазиду 25% клинических изолятов. Как правило, эти мутации обусловливают низкий уровень устойчивости к изониазиду (МПК1 мкг/мл) [16]. Большинство мутаций приводят к активации экспрессии гена inhA и, следовательно, к повышению содержания енол-кислой фосфатредуктазы, которая подавляет ингибирующее действие изониазида, участвуя в процессе детоксикации его активного промежуточного продукта [14, 17, 18].

После идентификации генов katG и inhA стало очевидным, что 10-20% изолятов, устойчивых к изониазиду, не имеют мутаций ни в одном из этих генов. В процессе поиска дополнительных генов был обнаружен ген ahpC, который кодирует алкил-гидропероксид-редуктазу. Этот фермент также участвует в детоксикации активного промежуточного продукта изониазида [11]. У многих бактерий ген ahpC контролируется геном oxyR, который регулирует ответ на окислительный шок. Интересно, что ген oxyR в клетках M.tuberculosis и M.bovis функционально не активен, тогда как в микобактериях других видов его функция не нарушена [19, 20]. По-видимому, в связи с нарушением работы генов oxyR и ahpC в клетках M.tuberculosis не происходит детоксикации промежуточного продукта изониазида, что, в свою очередь, делает микобактерии этого вида более чувствительными к препарату. Это обстоятельство может служить основой для изучения избирательной чувствительности различных видов Mycobacterium туберкулезного комплекса к изониазиду на молекулярном уровне [19]. До сих пор не ясно, в состоянии ли мутации в гене ahрC, идентифицированные приблизительно у 10% изолятов, компенсировать отсутствие гена oxyR [11]. Кроме того, остаются неизвестными механизмы устойчивости к изониазиду примерно у еще 10% клинических изолятов M.tuberculosis.

Устойчивость к рифампицину. Рифампицин является препаратом широкого антибактериального спектра действия, который участвует в синтезе мРНК, связываясь с РНК-полимеразой. Некоторые бактерии, например, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, приобретают устойчивость к рифампицину в результате образования мутаций в определенной области -субъединицы РНК-полимеразы (ген rpoB) [8, 21,22]. Микобактерии не являются исключением. Такие мутации обнаружены более чем у 97% клинических изолятов M.tuberculosis (кодоны от 507 до 533) [22], у устойчивых к рифампицину изолятов M.leprae [23, 24] и M.avium [25].

Мутации в гене rроB, приводящие к заменам аминокислот в определенных позициях: А->Т/233 (His->Leu), C->G/232 (His->Asp), A->T/203 (Asp->Val), C->T/248 (Ser->Leu), обнаружены у 13% рифампициноустойчивых изолятов (табл.2). Они обеспечивают высокий уровень устойчивости к рифампицину, но низкий - к рифабутину (МПК 0,25-0,5 мкг/мл) [26]. Эти МПК находятся в диапазоне концентраций, обнаруживаемых в сыворотке крови, но которые ниже достигаемых в пораженных тканях [27]. Очевидно, что при выделении у больных Rifr штаммов M.tuberculosis с мутациями в гене rpoB, для лечения можно довольно успешно использовать рифабутин.

Таблица 2. Мутации, детерминирующие устойчивость клинических штаммов M.tuberculosis к рифампицину (МПК > 50 мкг/мл)
N штамма M.tuberculosis	Фрагмент rpoB, п.о.	Мутация rpoB	IS 6110
31/2	431	А->Т/233, His->Leu*	+
38/2	431	C->G/232, His->Asp*	+
111/2	431	A->T/203, Asp->Val* G->A/395, Аrg->Gln**	+
14/2	431	C->T/248, Ser->Leu*	+
25/2	431	C->T/248, Ser->Leu*	+
109/3	431	A->T/203, Asp->Val*	+
28/10	431	C->T/248, Ser->Leu*	+
26/10	431	C->G/232, His->Asp*	+
29/7	431	C->T/248, Ser->Leu*	+
125/3	431	C->T/232, His->Tyr**	+
120/3	431	C->G/232, His->Asp**	+
158/6	431	C->T/248, Ser->Leu*	+
153/6	431	C->G/232, His->Asp*	+
44/2	431	C->T/248, Ser->Leu*	+
32/2	431	A->G/233, His->Arg*	+
141/6	431	C->T/248, Ser->Leu*	+
155/6	431	C->T/248, Ser->Leu*	+
41/8	431	GA->TT/202-203, Asp->Phe**	+
147/6	431	C->T/248, Ser->Leu*	+
69/8	431	A->C/194, Gln->Pro*	+
46/8	431	GA->TT/202-203, Asp->Phe**	+
2/7	431	C->T/221, Ser->Leu**	+
4361	431	G->T/202, Asp->Tyr**	+
12/7	429	A->T/91, Met->Leu** T->C/227, G->C/228 Leu->Ser** G->A/349, A->G/350, G->T/351 Glu->Ser**, GGG/354 Glu**	+
53/8	414	D199-207ATGGACCAG Met Asp Gln**	+

Примечание: IS 6110 - специфическая последовательность для клеток семейства микобактерий туберкулезного комплекса.
*Мутации, выявленные Telenti и др. [22].
**Мутации, выявленные Е.А. Панферцевым и др. [21, 28].

Е.А. Панферцевым и др. [21, 28] при изучении молекулярных механизмов устойчивости к рифампицину выделенных на территории Российской Федерации клинических штаммов M.tuberculosis выявлен в области 400 п.о., определенной ранее Telenti и др. [22], ряд дополнительных мутаций, детерминирующих высокий уровень устойчивости (МПК 70 мкг/мл) (см. табл. 2).

Далее...