|
П.А. Гоголевский Московский центр по лечению бесплодия ЭКО
В начало...
(Продолжение)
В работе Levran D. с соавт. [18] с помощью открытой тестикулярной биопсии были получены сперматиды в 9 циклах у 5 пациентов. Процент клеток, лизировавших после инъекции, составил 9,5%. Частота оплодотворения и дробления составили 58% (49/84) и 43% (28/49) соответственно. Однако качество эмбрионов было довольно низким и 86% из них имело более 30% фрагментации. В общей сложности было перенесено 28 эмбрионов, что в среднем составило 3,5 1,5 на ПЭ. Беременность не наступила ни в одном из случаев. Полученные результаты выявили приемлемую частоту оплодотворения с использованием КС, однако был показан довольно высокий процент блока дробления и низкое качество получаемых эмбрионов.
У 23 из 75 (30,7%) пациентов, страдающих необструктивной азооспермией, смогли получить сперматиды [1]. Причем в 15 случаях удалось получить круглые сперматиды и оставшихся 8 - удлиненные. Оплодотворение наступило в 62 инъецированных ооцитах (41%) и дробление произошло в 53 оплодотворенных ооцитах (85%). ПЭ имел место в 16 циклах (69,5%). Беременность не наступила ни в одном случае.
Lee D. R. с соавт. [17] выполнили работу для того, чтобы оценить присутствие КС и сперматозоидов в тестикулах пациентов, страдающих необструктивной формой азооспермии. Тестикулярная ткань была получена от 52 мужчин с помощью множественной тестикулярной биопсии. У пациентов с гипосперматогенезом (13) КС наблюдали во всех случаях и сперматозоиды в 9 случаях, КС и сперматозоиды были обнаружены в 13 и 6 случаях при блоке созревания (17) и 15 и 5 случаях при синдроме только клеток Сертоли (22) соответственно. Применение КС для инъекции в цитоплазму ооцитов привело к меньшей частоте оплодотворения и наступления беременности по сравнению с ИКСИ нормальными тестикулярными сперматозоидами.
During S.A. с соавт. [11] использовали КС от пациентов, страдающих необструктивной формой азооспермии, и получили 31% оплодотворения. После выполненных ПЭ наступило 2 беременности.
В работе Tanaka A. с соавт. [33] в программу по изучению инъекции КС в ооциты было включено 15 мужчин, страдающих секреторной формой азооспермии с блоком сперматогенеза на стадии круглых сперматид и высоким уровнем ФСГ (>20 mlU/ml). Для активации ооцитов за 60-120 мин до инъекции использовали электрические импульсы. В общей сложности оплодотворилось 62% ооцитов (95 из 153) и из них 64 (67%) имели 2 пронуклеуса. Одна наступившая беременность закончилась абортом.
В другой работе Tanaka A. с соавт. [34] изучали влияния электрической и механической стимуляции (ЭС и МС) на оплодотворение и дальнейшее развитие эмбрионов после инъекции круглых сперматид. Частота нормального оплодотворения, дробления и развития эмбрионов до стадии бластоцисты составила 66,1%, 77,6%, 17,6% при ЭС и 50%, 67% и 16,7% соответственно при МС. Было показано, что после 48 часов культивирования in vitro у 22,2% круглых сперматид начинает формироваться хвостик и что инъекция таких сперматид более эффективна, чем инъекция КС даже с применением электрических или механических стимуляторов и приводит к 82,4% нормального оплодотворения и 35,7% развития полученных эмбрионов до стадии бластоцисты.
Kanraman S. с соавт. [14] провели лечение 23 мужчин, страдающих необструктивной формой азооспермии, у которых с помощью открытой биопсии были получены пробы тестикулярной ткани. В 20 случаях в пробах были обнаружены только КС и также в 3 случаях обнаружены удлиненные сперматиды. Частота оплодотворения и дробления после инъекции КС и УС составила 26,1%, 15,1% и 70,9%, 51,6% соответственно. Всего было выполнено 19 ПЭ (43 эмбриона) и получено три беременности (15,7% на ПЭ). Одна беременность, полученная с КС, закончилась абортом. Оставшиеся две, полученные с УС, были дву- и трехплодными. Трехплодная беременность закончилась абортом в первом триместре, а двухплодная - рождением нормальных детей. Более высокая частота оплодотворения с помощью удлиненных и удлиняющихся сперматид была получена, что говорит о влиянии на исход ИКСИ используемой стадии сперматид. При использовании КС наблюдали больший процент анормального оплодотворения, темпы дробления были медленнее и качество получаемых эмбрионов хуже.
Mansour R.T. с соавт. [19] получили 41% оплодотворения после инъекции сперматид в ооциты и наступление беременности в 1 случае (9%) после ПЭ.
В работе Araki Y. с соавт. [6] 36 мужчин с азооспермией проходили тестикулярную биопсию и у 9 пациентов были получены только сперматиды, которые были использованы для проведения ИКСИ. Были получены три беременности, закончившиеся рождением здоровых детей.
Prapas c соавт. [27] провели 8 лечебных циклов с использованием сперматид. Частота оплодотворения и дробления составила 38% и 84% соответственно. Было получено две беременности.
Barak Y. [8] описывает случай наступления беременности после переноса однопронуклеарных эмбрионов. В данной работе удлиненные сперматиды были инъецированы в 137 ооцитов, полученных в 13 циклах, и 37 ооцитах в 13 циклах инъецированы КС. Частота нормального оплодотворения составила 35,8% для УС и 27% для КС. Частота формирования однопронуклеарных ооцитов составила 17,5% для УС и 35% для КС. Была получена одна прогрессирующая беременность.
Обсуждение
Таким образом, ранние (круглые) или поздние (удлиненные, удлиняющиеся и зрелые) сперматиды, полученные из эякулята или тестикулярной ткани, могут быть использованы для проведения цитоплазматической инъекции. Однако частота наступления беременности после инъекции сперматид остается очень низкой. И, хотя инъекция круглых и поздних сперматид в ооциты может индуцировать оплодотворение, развитие эмбрионов, наступление беременности и рождение нормальных детей, большое количество вопросов остается до конца невыясненными.
В настоящее время нет единого мнения какой источник получения сперматид предпочтительней - эякулят или тестикулярная ткань.
Одним из важных аспектов использования сперматид для инъекции в ооциты является тип инъецированных клеток (КС или УС). Было показано преимущество использования УС по сравнению с КС. Это может быть объяснено следующими факторами: 1) транскрипция некоторых генов, которая имеет место в КС завершается на стадии поздних сперматид, 2) морфологически данные клетки легче идентифицировать, 3) возможно, что содержащийся в УС фактор/факторы более компетентен для активации ооцитов.
Спермиогенез - процесс при котором круглые сперматиды трансформируются морфологически и биохимически в удлиненные тестикулярные сперматозоиды. Сперматиды формируются после мейотического деления вторичных сперматоцитов и они, как и сперматозоиды, содержат гаплоидный набор хромосом (1нДНК). Главные события во время спермиогенеза состоят из конденсации и изменения формы ядра, развитие акросомы и реорганизации и уменьшения цитоплазмы.
Более детальное изучение следует посвятить зрелости ДНК и конденсации хроматина. Показано, что во время спермиогенеза гаплоидные ядра сперматид крысы имеют широко диспергированный хроматин с небольшим скоплением гетерохроматиновых участков ядрышек. Такой диспергированный хроматин во время спермиогенеза проходит конденсацию, в котором различают два главных события. В первом происходит замена нескольких тестисспецифических гистонов, присутствующих в сперматоцитах и КС, основными протеинами сперматид. Это процесс постепенно происходит во время изменения формы ядра и конденсации хромосом. Во втором основные белки сперматид замещаются протаминами богатыми аргинином и цистеином. Ассоциация этих протеинов с ядерной ДНК обеспечивает конденсацию и стабилизацию хроматина. Процесс замещения гистонов протаминами происходит в начале стадии удлиненных сперматид. Было также показано, что протамины синтезируются до конца спермиогенеза и что хроматин мужских гамет в середине процесса спермиогенеза претерпевает изменение, когда в ядрах сперматид прекращается транскрипция. Эта пауза в РНК синтезе завершается после оплодотворения, когда протамины мужского пронуклеуса будут замещены гистонами ооцита. Эти данные могут в какой-то мере объяснить более высокую частоту оплодотворения с удлиненными сперматидами, чем с круглыми.
Одним из критических моментов выполнения данной процедуры является точная идентификация различных клеток, особенно КС. И хотя некоторыми группами получены удовлетворительные результаты в плане частоты оплодотворения, используя обычный инвертированный микроскоп, Miyagawa с соавт. [21] рекомендуют использовать для этих целей кофокальный сканирующий лазерный микроскоп или микроскоп, укомплектованный компьютерной системой. Ряд работ посвящен правильной идентификации КС в эякуляте или тестикулярных образцах [2]. Zavos M. с соавт. [43] разработали метод с использованием градиента Перколла для отделения КС в образцах эякулята мужчин, страдающих необструктивной формой азооспермии. Вращательное движение сперматид говорит о том, что данные клетки живые и их использование для инъекции предпочтительней, чем неподвижных сперматозоидов [9]. При выявлении подвижных сперматозоидов в образце их следует использовать в первую очередь. При выполнении ИКСИ сперматозоиды ответственны за активацию ооцитов путем увеличения внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция. Этот эффект опосредован специфическим цитозольным фактором сперматозоида (SCF, осцилин), который выделяется в цитоплазму ооцита [13,35]. Avrech O.M. с соавт. [7] изучили влияние введения SCF в неоплодотворенные ооциты на активацию и эмбриональное развитие. Было показано, что инъекция SCF в неоплодотворившиеся после ИКСИ и КС инъекции ооциты индуцирует активацию с последующим дроблением зигот. Микроинъекция SCF вместе с неподвижными сперматозоидами или с изолированными ядрами КС повышает частоту оплодотворения мышиных ооцитов [16]. Последние исследования показали, что как КС, так и УС содержат спермальный растворимый фактор. Однако активность осцилина сперматид требует активатора для запуска осцилляции ионов Са2+, и этим активатором может быть аспирация ооплазмы во время проведения процедуры ИКСИ, добавления Са-ионофора в культуральную среду после инъекции или электростимуляция.Также показано, что SCF активность во время сперматогенеза появляется на стадии между вторичными сперматоцитами и круглыми сперматидами.
Показанием для использования сперматид для оплодотворения с помощью ИКСИ могут быть также случаи необъяснимого отсутствия сперматозоидов в эякуляте или тестикулярном аспирате в день пункции, несмотря на то, что в предварительном исследовании были обнаружены сперматозоиды. Именно у таких пациентов были получены три первые беременности [12, 13, 34, 35]. Избежать этого можно с помощью криоконсервации сперматозоидов, полученных при диагностических тестикулярных биопсиях.
Интересным оказалось, что приемлемая частота оплодотворения была достигнута после инъекции сперматид, полученных у пациентов с положительной предварительной биопсией. Эти результаты были получены как в ОА группе, так и в НОА [39]. Низкий процент оплодотворения и высокая частота блока развития эмбрионов отражает низкий потенциал КС, полученных из патологических яичек (негативная предварительная диагностическая биопсия) инициировать нормальное оплодотворение и последующее дробление ооцитов. Не совсем ясно, каким образом это оказывает такой эффект на исход инъекции. Возможно, что сперматиды, полученные из очень патологических яичек, не полностью идентичны сперматидам извлеченных из яичек имеющих фокально сохранившийся сперматогенез. Вероятно, что потенциал сперматид, полученных у мужчин с предварительной положительной биопсией, выше в плане частоты оплодотворения и дробления по сравнению с тем же типом клеток, полученных при негативной биопсии. Это может быть объяснено деконденсированным состоянием хромосом сперматид, особенно КС. Таким образом, ДНК-мутации могут происходить в таком нестабильном состоянии, что объясняет низкую частоту имплантации [38,39].
Далее...
Написать комментарий
|
