|
А.В. Кузнецов, А.Б. Жаданов, И.В. Кузнецова, И.Ю. Щит ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск, Московская область, Институт молекулярной биологии РАН, Москва
В начало...
(Окончание)
Интеграция в геном интродуцированной последовательности ДНК. Хромосомная ДНК из ушей 9 крольчат в возрасте 1 мес (N 2, 5, 6, 14, 26, 28, 29, 34 и 43) была гидролизована рестриктазой EcoRI, а потом исследована при помощи Саузерн-блотинга и гибридизации с зондом [32P]-pRK3lacZ. В пробах 2, 5, 6 (5хC1), 14 (5хC2) и 26 (5хC3) обнаружено по два утяжеленных фрагмента: более 23 т.п.н. и около 10 т.п.н. (рис. 3), что свидетельствует о присутствии в составе последовательности экзогенной ДНК одного EcoRI-сайта (см. рис. 1) и может указывать на сайт-специфическую интеграцию 1 копии трансгена с геномом. Помимо этого, отмечено слабое распределение сигнала в области, заключенной между указанными рестриктами. Такая картина характерна для рассеянных по геному повторов. Проведенная Н.А. Зиновьевой в лаборатории G. Brem (Германия) гибридизация этой же ДНК с радиоактивным SacI-фрагментом гена lacZ длиной 1121 п.н. также привела к засветке радиоавтографов.
 |
Рис. 3. Блот-гибридизация с хромосомной ДНК, гидролизованной рестриктазой EcoRI М - маркеры, смесь HindIII и HindIII, KpnI-рестриктов плазмиды pRK3lacZ; 2,5,14 - ДНК кроликов N 2, 5, 14; ВМ - фрагмент более 23 т.п.н.; НМ - рестрикт размером ~10 т.п.н. |
От позитивных кроликов: самца N 8 и самки N 2 по достижении ими половой зрелости было получено потомство. Хромосомную ДНК из ушей крольчат N 50-56 (F1) гибридизовали с меченой плазмидой pRK3lacZ, однако положительных сигналов не обнаружено.
У животных N 1-8, 14, 15 в возрасте 6 мес из ушей снова была выделена хромосомная ДНК и проанализирована с помощью дот-гибридизации на присутствие последовательности pRK3lacZ. Результат оказался отрицательным. Негативные результаты были получены также Т.С. Денисовой (ВНИИ СХБ, Москва) при Саузерн-анализе этих проб. Из печени, селезенки, почек, сердца, легких, мышцы, мозга и семенника кролика N 21 в возрасте 6 мес была выделена высокомолекулярная ДНК и гибридизована в точках с зондом pRK3lacZ. Слабые сигналы были зарегистрированы в печени, селезенке и почках.
Отсутствие фенотипического выражения гена lacZ у трансгенных особей. Продукт экспрессии гена lacZ искали в сыворотке крови 6-месячных подопытных животных N 1-8, 14, 15 и 21 при помощи цветной реакции с хромогенным субстратом  -галактозидазы -CPRG; активность бактериальной -галактозидазы не обнаружена. Фенотип животных не зависел от копийности трансгена и находился в пределах нормы (см. рис. 2, рис. 4).
 |
| Рис. 4. Кролики N 2, 5 и 14, полученные при помощи трансформированных сперматозоидов, в возрасте 6 мес. |
Обсуждение
В описанных экспериментах были опробованы разные сочетания способов трансформации сперматозоидов кролика (естественная, искусственная) и конформации ДНК (линейная, линейная + кольцевая). Чужеродные последовательности ДНК были зарегистрированы у животных месячного возраста только в случае использования смеси линейной и кольцевой форм плазмиды pRK3lacZ. Влияние топологии ДНК на эффективность ее переноса спермиями в яйцеклетки было отмечено нами ранее в экспериментах по транзиентной экспрессии последовательности pRK3lacZ в доимплантационных зародышах [18] и может указывать на упаковку чДНК в сперматозоидах в форме ротаксанов. Высокая (72,7%) частота обнаружения последовательности pRK3lacZ в потомстве крольчих, осемененных трансформированными сперматозоидами, также согласуется с результатами экспериментов по выявлению экспрессии индикаторного гена lacZ в доимплантационных эмбрионах [8]. Аналогичные результаты (~60% трансгенных особей) были получены другими авторами на курах [6] и пчелах [7]. Отметим, что более низкая доля появления позитивных особей при искусственной трансформации (47,1%) по сравнению с естественной (88,9%) может быть следствием гибели развивающихся эмбрионов (см. табл. 1).
Следует отметить что, как в работах J. De la Fuente и соавт. [4] и C. Milne и соавт. [7], в наших экспериментах экзогенная последовательность была обнаружена в геноме рожденных животных в малом числе копий (~0,04-0,4). При обработке хромосомной ДНК позитивных животных эндонуклеазой EcoRI и последующей гибридизации с линеаризованной плазмидой pRK3lacZ в качестве зонда вместо ожидаемых фрагментов размером 7,1 или 4,4 т.п.н. на блотах обнаружены по два высокомолекулярных рестрикта и слабая "засветка" между ними (см. рис. 3). Возможно, встраивание трансгена произошло в предпочтительное место повторяющейся последовательности, разбросанной по геному. Зарегистрировано не более 1 акта интеграции на клетку и потеря интродуцированной ДНК у 6-месячных животных. Плазмида pRK3lacZ не экспрессировалась, имела мозаичное распределение по тканям, не передавалась потомству и, возможно, была перестроена. Этот результат может быть следствием интеграции чужеродной ДНК в область нестабильных повторов либо указывать на ее персистенцию в автономном состоянии в виде высокомолекулярных ковалентно замкнутых структур. Полученные данные не исключают того, что в геном кроликов включилась только часть интродуцированной ДНК.
В литературе известен пример дифференцированного выщепления аденовирусной ДНК из соматических клеток трансгенных мышей [19]. Потеря вирусной последовательности RSV-LTR в результате встраивания плазмиды pMA3 в геном мыши была описана ранее В.З. Тарантулом и соавт. [9]. В этой же работе приводятся факты интеграции микроинъецированной ДНК в эволюционно-консервативную повторяющуюся последовательность. В экспериментах G. Zoraqi и C. Spadafora [20] была зафиксирована интеграция фрагмента плазмиды pSV2cat в уникальный сайт генома спермия мыши вблизи консенсусной последовательности для топоизомеразы II. Определяющая роль разрывов ДНК под действием топоизомеразы II в событии незаконной интеграции была доказана A. Bodley и соавт. [21] на примере клеток, инфицированных вирусом SV-40. Эти исследователи продемонстрировали факт интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина с последующим формированием высокомолекулярных комплексов ДНК. G. Zoraqi и C. Spadafora [20] наблюдали появление сходных высокомолекулярных компонентов в результате инкубации сперматозоидов мыши с плазмидной ДНК pSV2cat. Авторы подчеркивают, что такие структуры скорее представляют продукты рекомбинации, чем мультимерные формы плазмид, так как они не расщеплялись до мономеров в результате рестрикции по HindIII-сайту, расположенному в плазмиде pSV2cat. Подобные высокомолекулярные комплексы, устойчивые к EcoRI-рестрикции, обнаружены и в наших экспериментах с плазмидой pRK3lacZ на кроликах (см. рис. 3).
Таким образом, приведенные в настоящей работе факты свидетельствуют о том, что перенос чДНК сперматозоидом в ооцит и ее интеграция с хозяйской ДНК - контролируемые спермием и яйцеклеткой процессы. По этому поводу высказывалось мнение, что способность чДНК включаться в геном зависит от уровня ретровирусной активности в ранних эмбрионах [22]. Полученные нами результаты подтверждают данные о том, что чужеродные последовательности ДНК способны перколировать ("просачиваться") в геном зиготы при оплодотворении [3-7]. Не исключено, что в процессе интеграции чДНК с хромосомой некоторые последовательности ДНК получают селективное преимущество. Дальнейшие исследования должны пролить свет на механизм включения привнесенной спермием ДНК в геном зиготы. Знания, полученные в этой области, не только необходимы для оптимизации процедуры трансформации сперматозоидов с целью получения трансгенных животных, но и могут быть полезны при определении нормативов для оплодотворения in vitro в клинике, а также для более глубокого понимания эволюционных и генетических процессов.
Авторы считают своим долгом выразить признательность В.А. Сигаевой, Н.А. Зиновьевой и Т.С. Денисовой за содействие, И.В. Беликовой и Ж.В. Калмыковой за помощь в работе с животными.
Проблемы репродукции, N1-1998, с.38-43
1. Grosveld F., Kollias G. Transgenic animals. London: Academic Press 1992; 277.
2. Wall R.J., Seidel Jr. Transgenic farm animals - a critical analysis. Theriogenology 1992; 38: 337-357.
3. Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V.M., Dolci S., Farace M.G., Spadafora C. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 1989; 57: 717-723.
4. De la Fuente J., Castro F.O., Hernandez O., Guillen I., Ullver C., Solano R., Milanes C., Agullar A., Lleonart R., Martinez R., Perez A., de Armas R., Herrera L., Limonta J., Cabrera E., Herrera F. Sperm mediated foreign DNA transfer experiments in different species. Symposium Biotech. Washington USA 1990.
5. Gandolfi F., Lavitrano M., Camaioni A., Spadafora C., Siracusa G., Lauria A. The use of sperm-mediated gene transfer for the generation of transgenic pigs. J Reprod Fert Abstr 1989; 4: 21.
6. Gruenbaum Y., Revel E., Yarus S., Fainsod A. Sperm cells as vectors for generation of transgenic chickens. J. Cell Biochem. 1991; Suppl. 15E: 194.
7. Milne C.P., Jr., Elschen F.A., Collis J.E., Jensen T.L. Preliminary evidence for honey bee sperm-mediated DNA transfer. International Symposium on Molecular Insects Science. Tucson USA 1989; 3-7.
8. Кузнецов А.В., Кузнецова И.В. Связывание экзогенной ДНК pRK3lacZ сперматозоидами кролика, ее перенос в ооциты и экспрессия в доимплантационных эмбрионах. Онтогенез 1995; 26: 4: 300-309.
9. Тарантул В.З., Кучерявый В.В., Макарова И.В., Баранов Ю.Н., Бегетова Т.В., Андреева Л.Е., Смирнова М.Б., Газарян К.Г. Клонирование фрагмента ДНК трансгенной мыши, содержащий интегрированную рекомбинантную плазмиду. Молекул биол 1986; 20: 1: 278-286.
10. Gasser C.S., Simonsen C.C., Schilling J.W., Schimke R.T. Expression of abbreviated mouse dihydrofolate reductase genes in cultured hamster cells. Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79: 21: 6522-6526.
11. Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера М: Мир 1988; 538.
12. Газарян К.Г., Андреева Л.Е., Серова И.А., Тарантул В.З., Кузнецова Е.Д., Хайдарова Н.В., Генинг Л.В., Кузнецов Ю.М., Газарян Т.Г., Смирнов А.Ф., Козикова Л.В., Ефимов А.М. Получение трансгенных кроликов и мышей, содержащих ген гормона роста быка. Молекул генетика 1988; 10: 23-26.
13. Коробко В.Г., Добрынин В.Н., Нгуен Куанг Винь, Подладчикова О.Н., Северцова И.В., Быстров Н.С., Болдырева Е.Ф., Чувпило С.А., Колосов М.Н. Плазмидные векторы с полусинтетическим геном -галактозидазы E.coli. Биоорганхимия 1983; 9: 9: 1285-1289.
14. Новое в клонировании ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера М: Мир 1989; 368.
15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М: Мир 1984; 480.
16. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Под. ред. Р.И. Салганика Новосибирск: Наука, 1990; 248. 17. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий. М: Мир 1984; 155. 18. Кузнецов А.В., Кузнецова И.В. Попытки получения трансгенных животных с помощью подвижных векторов. Генноинженерные сельскохозяйственные животные: Сборник научных трудов. (Выпуск 1). РАСХН. М 1995; 173- 180.
19. Тарантул В.З., Кузнецова Е.Д., Андреева Л.Е., Серова И.А., Газарян К.Г. Дифференцированное выщепление аденовирусной ДНК из соматических клеток трансгенных мышей. Онтогенез 1988; 19: 4: 443.
20. Zoraqi G., Spadafora C. Integration of foreign DNA sequences into mouse sperm genome. DNA and Cell Biology 1977; 16: 3: 291-300.
21. Bodley A.L., Huang H.C., Yu C., Liu L.F. Integration of Simian virus 40 into cellular DNA occurs at or near topoisomerase II cleavage hot spots induced by VM-26 (teniposide). Mol Cell Biol 1993; 13: 6190-6200.
22. Erickson R.P. Are intermediate vectors needed between foreign DNA on sperm and the nucleus? Immunology Today 1990; 6: 2: 31.
Написать комментарий
|
