|
A. Stecher*, P. Vaderzwalmen**, I. Riedler*, N. Zech*, H. Zech* *Institute fur Reproduktionsmedizin und Endokrinologie, Austria; **SIMAF, Belgien
В начало...
(Окончание)
На 34 пациента (табл. 3) было витрифицировано 86 эмбрионов (24 в стадии морулы, 23 в стадии бластоцисты и 39 в стадии экспандированной бластоцисты). После оттаивания для переноса в нашем распоряжении было всего 64 (74%) эмбриона. ПЭ был выполнен у 91% пациентов. В результате была зафиксирована прогрессирующая беременность в 15% на витрификацию/пациента и 16% на имплантацию/пациента. Наиболее высокая частота наступления беременности была достигнута при переносе ранних бластоцист.
| Таблица 3. Выживаемость in vitro витрифицированных человеческих эмбрионов после двухэтапной витрификации (3 мин в EG 20 и 1 мин в EFS) |
| |
Морула |
Бластоцисты |
Экспандированные бластоцисты |
Всего |
| Число пациентов |
8 |
8 |
18 |
34 |
| Число витрифицированных эмбрионов |
24 |
23 |
39 |
86 |
| Число эмбрионов на имплантацию (%) |
17 (71%) |
18 (78%) |
29 (74%) |
64 (74%) |
| Число имплантаций |
7 |
8 |
16 |
31 (91%) |
| Среднее количество эмбрионов на имплантацию |
2,4 |
2,3 |
1,8 |
2,0 |
| Прогрессирующая беременность на имплантацию (%) |
1/7 (14,2%) |
2/8 (25%) |
2/16 (12,5%) |
5/31 (16%) |
| Прогрессирующая беременность на витрификацию |
1/8 (12,5%) |
2/8 (25%) |
2/18 (11%) |
5/34 (15%) |
| Частота имплантации |
6% |
11% |
7% |
8% |
Частота беременности по отношению к дню витрификации показана в табл. 4. Если эмбрионы были витрифицированы на стадии морулы, то беременность развивалась только у тех эмбрионов, которые были в возрасте 4 дней стадии морулы. Тоже самое можно было наблюдать с бластоцистами. Если эмбрионы отставали в своем развитии, беременность не наступала. Имплантация 5-дневных эмбрионов, которые были в стадии экспандированной бластоцисты, привела к одной беременности, но, однако, этого не случилось с эмбрионами, достигшими стадии бластоцисты на 4-й или 6-й день.
| Таблица 4. Частота беременности в зависимости от дня витрификации |
| |
4-й день |
5-й день |
6-й день |
| Морула |
| число пациентов |
6 |
2 |
|
| количество имплантаций |
6 |
1 |
|
| беременность |
1 |
0 |
|
| Бластоциста |
| число пациентов |
2 |
2 |
2 |
| количество имплантаций |
2 |
2 |
2 |
| беременность |
1 |
0 |
0 |
| Экспандированная бластоциста |
| число пациентов |
1 |
9 |
6 |
| количество имплантаций |
1 |
9 |
4 |
| беременность |
0 |
2 |
0 |
Дискуссия
Витрификация облегчает и упрощает процесс замораживания эмбрионов. Преимущество этого метода в том, что эмбрионы повреждаются кристаллами льда, как это происходит при контролируемой медленной криоконсервации. Единственный недостаток витрификации - химическая токсичность, которая прямо коррелирует с концентрацией криопротектора, временем и температурой экспозиции эмбриона в этом растворе.
Коэффициент проницаемости находится в прямой связи с молекулярным весом и является мерой скорости проникновения криопротектора в эмбрион или, наоборот, выхода из него. Низкий молекулярный вес является преимуществом, так как криопротектор показывает более высокую скорость попадания внутрь и выхода из эмбриона. Таким образом индуцируется меньшая химическая интоксикация, так как время экспозиции эмбриона в витрификационном растворе может быть сокращено.
Витрификационный раствор, который содержит этиленгликоль, менее токсичен, чем 1,2-пропандиол. В опытах с мышами Kasai оптимизировал витрификационный метод, в котором использовались 40% этиленгликоля, 30% фикола и 0,5М сахарозы.
Massip и др. [12] отмечают необходимость провести эквилибрирацию при более низкой концентрации криопротектора (EG 20), и только после этого экспозицию в течение короткого времени при более высокой концентрации (EFS). Таким образом, уменьшается токсичность и используется меньшая концентрация, которая может вызвать <образование льда>.
Результаты наших предварительных исследований (см. табл. 1) подтверждают, что этот витрификационный раствор имеет низкую токсичность.
Витрификация применяется к полученным in vitro морулам/бластоцистам, так как традиционные методы криоконсервации на этих эмбрионах не дают удовлетворительных результатов по сравнению с эмбрионами, развивавшимися in vivo в опытах с животными. Методы, которые применялись по отношению к эмбрионам, образовавшимся in vivo, были адаптированы для созданных in vitro эмбрионов. При этом оказалось, что данные эмбрионы были значительно чувствительнее по отношению к процессу криоконсервации. Повышенной чувствительности полученных in vitro эмбрионов к повреждениям из-за охлаждения можно избежать, используя достаточно быструю скорость охлаждения.
Эмбрионы, полученные in vitro и находящиеся на продвинутой стадии развития, обладают более высокой устойчивостью к витрификации, чем эмбрионы, находящиеся на более ранних стадиях развития. Наши результаты, представленные в табл. 2 и табл. 3, подтвердили эти опыты.
Потенциал развития бластоцист in vitro меньше, поэтому было заморожено меньше бластоцист, уровень выживаемости и частота наступления беременности для бластоцист выше.
Как видно из результатов, частота наступления беременности после витрификации составляет в среднем 16% на пациентку, уровень выживаемости и дальнейшее развитие витрифицированных человеческих эмбрионов (см. табл. 2) являются приемлемыми. Для бластоцист была достигнута наивысшая (25%) частота наступления беременности (см. табл. 3).
Темпы дробления, а именно скорость развития эмбрионов до стадии морулы или бластоцисты оказывает значительное влияние на уровень выживаемости и уровень беременности.
Подтверждением этому служат наши результаты (см. табл. 4). Эмбрионы, которые достигли стадии морулы/бластоцисты на 4-й день, приводили к беременности в каждом случае. Также и с экспандированными бластоцистами, которые достигли зрелости уже на 5-й день, было достигнуто 2 беременности. Для эмбрионов с более замедленными темпами развития было невозможно достичь имплантации. Это подтверждает наблюдение Massip и соавт., что отстающие в своем развитии эмбрионы хуже поддаются криоконсервации.
Определение <развитие> базируется в наших результатах исключительно на оценках бластомеров с помощью светового микроскопа. Задача дальнейших исследований состоит в том, чтобы точнее определить потенциал развития и, например, использовать в качестве индикаторов различные модели протеинов.
Преимущества витрификации состоят в том, что уровень выживаемости для in vivo и in vitro полученных эмбрионов является приемлемым, что показывают и наши результаты (см. табл. 3, табл. 4). Потенциальная опасность повреждений из-за образования кристаллов льда в суспензии исключена. Витрификация представляет собой более быстрый способ, чем традиционные методы, к тому же здесь не нужно дорогое компьютеризированное оборудование.
Недостатки витрификации состоят в химической токсикации. Конечно, повреждения из-за эффекта охлаждения в традиционных медленных методах вероятно сильнее, чем химическая токсикация витрификационного раствора.
Длительная in vitro культура эмбрионов до стадии морулы или бластоцисты может сократить способность эмбрионов к развитию.
Чтобы усовершенствовать эту технику, необходимо улучшение культуральных систем для продвинутых стадий развития эмбриона (например, с помощью использования со-культур).
Необходимо использование метода витрификации на ранних стадиях развития, для сокращения времени содержания культуры in vitro.
Проблемы репродукции, N1-1998, с.22-25
Написать комментарий
|
