Созревание ооцитов внутри фолликулов с разной степенью развития микроциркуляторного русла

Т.А. Смирнова, Л.Д. Галиева

Всероссийский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, Ст.-Петербург, г. Пушкин

В начало...

Морфогистологическое исследование фолликулов в процессе культивирования выявило, что в интактных фолликулах и фолликулах 1-й степени атрезии толщина теки достоверно уменьшалась (табл. 4). Гранулеза хорошо развита. Среднее число слоев гранулезы составляло 8,6 - 9,8 и лишь при 40-часовом культивировании уменьшалось до 4 слоев. При культивировании фолликулов с 6 до 40 ч толщина гранулезы уменьшалась с 78 до 50 мкм за счет ее равномерной диссоциации. В процессе культивирования фолликулов 2-й степени атрезии (табл. 5) клетки теки и гранулезы оказывались дезорганизованными. Пикнотический индекс гранулезы и кумулюса возрастал в среднем в 2 раза по сравнению с аналогичными показателями у интактных фолликулов и 1-й степени атрезии. Иногда клетки гранулезы отторгались в фолликулярную жидкость. В полости фолликула наблюдали множество дегенерированных клеток и пикнотических ядер.

Таблица 4. Морфологическая характеристика интактных фолликулов и фолликулов 1-й степени атрезии в процессе культивирования
Время культивирования, ч	Число фолликулов	Пикнотический индекс			Среднее число слоев		Толщина, мкм
		теки	гранулезы	кумулюса	теки	гранулезы	теки	гранулезы
0	20	2,1	1,7	1,3	11,0	8,6	108,7	93,8
6	14	4,2	1,6	1,1	11,1	8,6	100,2	78,0
12	13	4,4	1,6	1,2	11,3	8,8	81,0*	57,0**
18	16	4,6	1,4	1,4	11,3	8,9	78,0*	55,0**
24	13	4,5	1,0	1,7	11,0	9,3	76,0*	57,0**
30	13	4,7	3,3	1,9	10,6	9,8	75,0**	57,0**
40	14	5,1	4,4	2,0	10,0	4,0	70,0**	50,0**
Примечание. Звездочками отмечены достоверные различия по отношению к контролю (время культивирования 0 ч): * - p<0,05, ** - p<0,001.

Таблица 5. Морфологическая характеристика фолликулов 2-й степени атрезии в процессе культивирования
Время культивирования, ч	Число фолликулов	Пикнотический индекс			Среднее число слоев		Толщина, мкм
		теки	гранулезы	кумулюса	теки	гранулезы	теки	гранулезы
0	12	2,7	2,2	1,2	11,9	8,4	119,0	102,0
6	15	6,9	2,0	2,2	11,0	8,7	111,0	78,0
12	15	6,5	3,1	2,5	11,2	8,5	100,0	69,0*
18	19	5,3	5,2	3,0	11,1	8,2	101,0	60,0*
24	14	5,7	5,3	2,9	11,3	9,1	108,0	66,0
30	13	5,5	5,3	2,9	11,6	10,0	105,0	67,0*
40	14	5,1	4,4	3,0	15,0	10,4	141,0	93,0
Примечание. Звездочками отмечены достоверные различия по отношению к контролю (время культивирования 0 ч): * p<0,05; ** p=0,01.

Таким образом, морфогистологический анализ фолликулов с разной степенью развития МЦР показал изменение клеточных структур фолликулов в процессе культивирования.

При оплодотворении яйцеклеток, созревших в неатретических фолликулах и фолликулах 1-й степени атрезии (1-я и 2-я группы), развитие продолжалось до интактных эмбрионов (табл.6).

Таблица 6. Оплодотворение in vitro яйцеклеток, созревших внутри фолликулов
Группы фолликулов	Число ооцитов	Число нераздробившихся яйцеклеток	Число интактных эмбрионов на стадиях дробления
			2	4-6	8-10	всего
1 и 2	62	49 (79,0)**	10 (16,1)*	2 (3,2)	1 (1,6)	13 (21)**
3	90	87 (96,7)	2 (2,2)	1 (1,1)	-	3 (3,3)
Примечание. В скобках - процент. Звездочками отмечена достоверность различия показателей 1-й и 2-й групп фолликулов в сравнении с 3-й группой; * - p<0,01, ** - p<0,001.

Морфологический и цитологический анализ эмбрионов, полученных из оплодотворенных яйцеклеток, созревших в интактных фолликулах и фолликулах 1-й степени атрезии (1-я и 2-я группы), выявил, что бластомеры эмбрионов в основном были одинаковы по величине и форме и во всех бластомерах были ядра. При оплодотворении яйцеклеток, созревших в фолликулах со 2-й степенью атрезии (3-я группа), наблюдали неравномерное дробление, фрагментацию, частичный лизис. При исследовании таких эмбрионов не во всех бластомерах выявлялись ядра.

Таким образом, из результатов нашей работы следует, что ооциты из интактных фолликулов и фолликулов 1-й степени атрезии в данных условиях культивирования способны к оплодотворению и дальнейшему развитию эмбрионов, а разработанный принцип разделения популяции фолликулов по состоянию МЦР позволяет прогнозировать не только состояние фолликулов, но и результаты созревания и оплодотворения.

Обсуждение результатов

В литературе известны единичные работы, в которых оценка фолликулов мышей, овец и коров проводилась по состоянию МЦР [5, 7, 15]. Разработанная нами классификация позволила комплексно оценить состояние фолликулов до и в процессе культивирования. Вся популяция фолликулов была разделена на 4 группы. В качестве основного прижизненного морфологического признака полноценности фолликула использовано состояние МЦР: степень его развития, равномерность контуров сосудов, наличие или отсутствие прерывистости.

Процесс атрезии антральных фолликулов многие исследователи разделяют на три последовательные стадии. Одним из важных показателей атретического процесса в тканях фолликулов служит появление пикнотических ядер. Вопрос о количестве пикнотических ядер в атретических фолликулах различными авторами решается неоднозначно [3, 7, 10, 12-17]. В нашей работе было показано, что по мере нарастания признаков атрезии увеличивается число пикнотических ядер в теке, гранулезе и кумулюсе. Самым устойчивым элементом фолликулов оказалась тека. Пикнотический индекс теки составил 7,0 0,76 в фолликулах 3-й степени атрезии. Такую высокую устойчивость теки можно объяснить, вероятно, наличием в этой ткани сосудов, выполняющих резорбтивную функцию. Нами было показано, что наиболее подверженной дегенерации в фолликулах является гранулеза. Причиной повышенной чувствительности клеток гранулезы служит, вероятно, отсутствие в ней сосудов, в результате чего происходит нарушение обменных и питательных функций этой ткани.

В литературе известны многие исследования по установлению числа интактных и атретических фолликулов в яичнике [3, 7, 10, 11, 17]. Проведенный морфологический анализ фолликулов показал, что наибольшее число интактных фолликулов содержится в яичниках на стадиях фолликулярного роста и развитого желтого тела. В яичниках на ранней лютеиновой стадии фолликулы в основном атретические.

В работе показано, что фолликулы коров обладают разной способностью к созреванию. Созревание ооцитов в интактных и 1-й степени атрезии фолликулах диаметром 2 - 5 мм происходит медленнее, чем созревание ооцитов в фолликулах 2-й степени атрезии. По-видимому, это связано с тем, что секреция клеток гранулезы в интактном фолликуле ингибирует созревание ооцита [6, 8, 9]. В атретических фолликулах значительная часть клеток, а иногда и вся гранулеза подвергается лизису. В результате этого ингибирующий эффект ослабевает и наступает реинициация мейоза. Культивирование фолликулов 2-й степени атрезии выявило значительное увеличение числа ооцитов с признаками дегенерации ядерного материала.

Таким образом, разная степень атретических изменений, происходящих в клетках теки, гранулезы и кумулюса, оказывает влияние на состояние ооцита, в частности на способность к созреванию вне организма [10].

В наших экспериментах за 30 ч культивирования 63,2% ооцитов в интактных фолликулах и фолликулах 1-й степени атрезии (1-я и 2-я группы) и 23,6% ооцитов в фолликулах 2-й степени атрезии (3-я группа) созревали до стадии метафазы II. При этом признаки дегенерации хромосом у фолликулов 1-й и 2-й групп отсутствовали, а у фолликулов 3-й группы выявлены в 17,6% случаев.

Таким образом, необходимо отметить, что в наших опытах в процессе культивирования наиболее существенные морфологические изменения происходили в гранулезе. Наименее выраженные изменения отмечены в теке. Клетки кумулюса занимали в этом отношении промежуточное положение. Атретические изменения, начавшиеся в гранулезе, а затем в кумулюсе и теке, затрагивают ооцит, что приводит к нарушению процесса оплодотворения яйцеклеток, полученных при созревании их в фолликулах со 2-й степенью атрезии.

Проблемы репродукции, N1-1998, с.5-9

Литература

1. Смирнова Т.А., Галиева Л.Д., Завертяев Б.П. и др. Цитоморфологическая оценка фолликулов коров. Пробл репрод 1995;2: 23-25.

2. Смирнова Т.А., Галиева Л.Д., Свиридов Б.Е. Цитогенетический анализ ооцитов антральных фолликулов. Пробл репрод 1996;4: 8-12.

3. Brand A., de Jong W.H.R. Qualitative and quantitative micromorphological investigations of the tertiary population during the oestrous cycle in sheep. J Reprod Fert 1973;33:431 - 439.

4. Campe del M.R., Campo del C.H., Mapletoft R.J., Ginter O.J. Morphology and location of atteched follicular cumulus-oocyte complexes in horses, cattle and llamas. Theriogenology 1995;43:533 - 542.

5. Driancourt M.A. Follicular dynamics in sheep and cattle. Theriogenology 1991;35:1:55 - 79.

6. Gouldiing D., Martin T.L., Williams D.H. et al. Effect of FSH on day 1 of the estrous cycle on follicule number and concentrations of inhibin in follicular fluid in heifers. Theriog-enology 1991;36:65:1049 - 1057.

7. Hinrichs K. The relationship of follicle atresia to follicle size, oozyte recovery rate on aspiration, and oocyre morphology in the mare. Theriogenology 1991;36:2:157 - 168.

8. Hopko Ireland, Janet L., Ireland J.J. Changes in expression of inhibin/activin and subunit messenger ribonucleic acids following increases in size and during different stages of differentiation or atresia of non-ovulatory follicles in cows. Biol Reprod 1994;50:492 - 501.

9. Hopko Ireland, Janet L., Good T.E.M. et al. Alterations in amounts of different forms of inhibin during follicular atresia. Biol Reprod 1994;50:1265 - 1276.

10. Hurk van den R., Dijkstra G., Hulshof S.C.J., Vos P.L.A.M. Micromorphology of antral follicles in cattle after prostaglandin-induced luteolysis, with particular reference to atypical granulosa cells. J Reprod Fertil 1994;100:137 - 142.

11. Katska L., Smorang Z. Number and quality of oocytes in relation to age cattle. Anim Reprod Sci 1984;7:5:451 - 460.

12. Kruip Th.A.M., Dieleman S.J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, guality and stage of the oestrus. Theriogenology 1985;24:4:395 - 408.

13. Kruip Th.A.M., Dieleman S.J. Intrinsinc and extrinsinc factors influencing steroid production in vitro by bovine follicles. Theriogenology 1989;31:3:531 - 544.

14. Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., First N.L. Fertilization potencial of follicular oocytes classified by stage of cycle and size of follicle. Theriogenology 1985;23:5:753 - 760.

15. Moor R.M., Seamark R.F. Cell signaling permeability and microvasculatory changes during antrale follicle development in mammals. J Dairy Sci 1986;69:3:927 - 943.

16. Romeis B. Mikroskopische Technik. Leibniz Verlag. Munchen 1948;159.

17. Webb R., Gauld I.K., Driancourt M.A. Morphological and functional characterization of large antral follicles in three breeds of sheep with different ovulation rates. J Reprod Fert 1989;87:243 - 255.