|
Т.А. Смирнова, Л.Д. Галиева Всероссийский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, Ст.-Петербург, г. Пушкин
В начало...
Описана динамика созревания ооцитов внутри фолликулов с разной степенью развития микроциркуляторного русла. Установлено, что созревание ооцитов в интактных и 1-й степени атрезии фолликулах диаметром 2-5 мм происходит медленнее, чем в фолликулах 2-й степени атрезии. При оплодотворении яйцеклеток, созревших в интактных фолликулах и в фолликулах 1-й степени атрезии, получены эмбрионы.
Ключевые слова:
Метод интрафолликулярного культивирования ооцитов разработан в начале 70-х годов. Основной причиной разработки этого метода послужило то обстоятельство, что при извлечении ооцитов из фолликулов нарушаются связи между ооцитом и клетками фолликула. Это приводит к изменениям структуры ооплазмы и ее функций. Надо полагать, что для созревания ооцитов необходимо участие многих элементов фолликулов [4]. Неудивительно, что в последнее время для полноценного созревания изолированных ооцитов используют совместное культивирование с клетками фолликулов. Интрафолликулярное культивирование представляет большой интерес в научном плане, так как этот способ позволяет изучать закономерности процессов, происходящих в фолликуле [15]. Целью настоящей работы являлось изучение изменений структур интактных и атретических фолликулов до и в процессе их культивирования, а также способности к оплодотворению яйцеклеток, созревших внутри фолликула, и дальнейшему развитию эмбрионов.
Материалы и методы
Выделение и оценка фолликулов
Антральные фолликулы диаметром 2-5 мм выделяли из яичников коров в разных стадиях полового цикла. При этом фолликулы со слабым тургором, "белесые", "серые", с темными пятнами в опытах не использовали. Выделенные фолликулы оценивали по состоянию и степени развития микроциркуляторного русла (МЦР) [1, 2]. Степень развития МЦР оценивали по 5-балльной системе. По исследуемым признакам популяция фолликулов была разделена на 4 группы: 1-я группа - фолликулы с обширной васкуляризацией, представленной плотной сетью капилляров без признаков дегенерации. Контуры сосудов ровные, без расширений, прерывистости (интактные фолликулы); 2-я группа - фолликулы с развитым МЦР, представленным более крупными микрососудами без признаков дегенерации (1-я степень атрезии); 3-я группа - фолликулы со слаборазвитым МЦР без признаков дегенерации, сеть капилляров отсутствовала (2-я степень атрезии); 4-я группа - фолликулы, МЦР которых имело признаки дегенерации (неровность контура, прерывистость сосудов) (3-я степень атрезии).
Культивирование фолликулов
Культивирование фолликулов проводили в роллерной установке в закрытых сосудах со специальной газовой смесью: 5% CO2, 55% O2, 40% N2. Время инкубации 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 ч. В качестве культуральной среды использовали Ham F-10 с добавлением FCS (20%), ФСГ (5 мкг/мл), ЛГ (5 мкг/мл), эстрадиола (1 мкг/мл), инсулина (1 мкг/мл).
В результате предварительных исследований установлено, что в процессе культивирования фолликулов 1-й и 2-й групп между ними не существует выраженных морфологических и цитологических различий, поэтому фолликулы этих групп были объединены. Фолликулы 4-й группы для культивирования не использовались из-за глубоких деструктивных изменений всех их составных структур.
Оплодотворение ооцитов, созревших внутри фолликулов
Яйцеклетки, созревшие в фолликулах, выделяли и осеменяли капацитированными сперматозоидами быка. Продолжительность совместной инкубации яйцеклеток со сперматозоидами составляла 24 ч, после чего клетки переносили в свежеприготовленную среду. Первый просмотр клеток проводили через 28 ч после осеменения. При обнаружении признаков оплодотворения - наличие второго полярного тельца и борозды дробления - яйцеклетки инкубировали 24 - 78 ч.
Гистологический и цитогенетический методы
Через каждые 6 ч культивирования проводили гистологическое исследование фолликулов и готовили препараты мейотических хромосом. Фолликулы фиксировали в растворе Буэна, Карнуа. Заливку осуществляли через парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм, проходящие через ядро ооцита, окрашивали гематоксилином по Эрлиху или Бемеру [16].
Препараты мейотических хромосом ооцитов готовили по методу Тарковского и окрашивали раствором Гимзы.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением критерия Стьюдента и критерия х2.
Результаты
Для гистологического анализа было использовано 80 интактных фолликулов, по 20 фолликулов в каждой группе. Результаты гистологического анализа показали, что степень развития и состояние МЦР фолликулов коррелируют с состоянием всех клеточных структур фолликулов [1, 2, 5]. Фолликулы исследовали в зависимости от цикла яичника, степени развития и состояния МЦР (табл.1).
| Таблица 1. Соотношение интактных и атретических фолликулов в яичнике |
| Диаметр фолликулов, мм |
Общее число исследованных фолликулов |
Число (в %) фолликулов |
| интактные |
степень атрезии, % |
| 1-я |
2-я |
3-я |
всего |
| Яичники в стадии фолликулярного роста |
| 2-3 |
78 |
17,8 |
20,5 |
61,6 |
- |
82,1 |
| 4-5 |
118 |
3,4 |
35,6 |
49,1 |
11,9 |
96,6 |
| Итого |
196 |
9,2 |
29,6 |
54,1 |
7,1 |
90,8 |
| Яичники в ранней лютеиновой стадии |
| 2-3 |
74 |
- |
26,9 |
73,0 |
- |
99,9 |
| 4-5 |
112 |
3,6 |
33,9 |
51,8 |
10,7 |
96,4 |
| Итого |
186 |
2,1 |
31,2 |
60,2 |
6,5 |
97,9 |
| Яичники на стадии развитого желтого тела |
| 2-3 |
100 |
12,0 |
20,0 |
62,0 |
6,0 |
88,0 |
| 4-5 |
196 |
4,1 |
40,8 |
39,8 |
15,3 |
95,9 |
| Итого |
296 |
6,7 |
33,8 |
47,3 |
12,3 |
93,3 |
Как видно из табл. 1, 82,1 - 99,9% фолликулов, выделенных из яичников разных стадий цикла, являлись атретическими, в том числе 90,8% на стадии фолликулярного роста, 97,9% на ранней лютеиновой стадии и 93,3% на стадии развитого желтого тела. Наибольшее число интактных фолликулов содержалось в яичниках на стадиях фолликулярного роста и развитого желтого тела (9,2 и 6,7%).
Изучение состояния хроматина ооцитов, выделенных из фолликулов с различной степенью развития МЦР, показало, что в фолликулах с обширной васкуляризацией (1-я группа) ядерный материал ооцитов не имел признаков дегенерации. При уменьшении васкуляризации фолликулов 2-й и 3-й групп наблюдали возрастание числа ооцитов с признаками дегенерации хромосом (15,7 и 42,8% соответственно). Максимальное число (73,5%) таких ооцитов находилось в фолликулах с признаками дегенерации МЦР (4-я группа).
Таким образом, результаты цитологического анализа ооцитов, выделенных из фолликулов с различной степенью развития МЦР, свидетельствуют, что фолликулы с обширной и развитой степенью васкуляризации (1-я и 2-я группы) имеют наименьшее число ооцитов с признаками дегенерации хромосом.
Изучение динамики созревания интактных и 1-й степени атрезии интрафолликулярных ооцитов (1-я и 2-я группы) показало, что максимальное число ооцитов (47,8%) достигало стадии метафазы I без признаков дегенерации за 24 ч культивирования, а метафазы II - за 30 ч культивирования 63,2% (табл. 2). На всех стадиях мейоза доля ооцитов с признаками дегенерации ядерного материала оставалась низкой.
| Таблица 2. Динамика созревания ооцитов в интактных фолликулах и фолликулах 1-й степени атрезии |
| Время культивирования, ч |
Число фолликулов |
Ооциты, % |
| диплотена |
метафаза I |
телофаза I - метафаза II |
| норма |
дегенерация |
норма |
дегенерация |
норма |
дегенерация |
| 0 |
45 |
90,6 |
8,6 |
0,2 |
0,2 |
- |
0,4 |
| 6 |
40 |
87,0 |
8,0 |
4,6 |
0,2 |
- |
0,2 |
| 12 |
42 |
62,0 |
1,3 |
20,0 |
- |
16,7 |
- |
| 18 |
56 |
31,1* |
3,0 |
42,6** |
0,8 |
20,7 |
1,8 |
| 24 |
124 |
15,7* |
2,9 |
47,8** |
1,4 |
30,2* |
2,0* |
| 30 |
46 |
10,0* |
- |
25,6** |
1,2 |
63,2* |
- |
| 36 |
43 |
7,6* |
5,4 |
23,0** |
1,6 |
58,8* |
3,6** |
| 42 |
49 |
7,3* |
6,1 |
22,0** |
6,0 |
54,0 |
4,6** |
| Примечание. Звездочками отмечены достоверные различия по отношению к контролю (время культивирования 0 ч): * - p<0,05, ** - p<0,001. |
При культивировании фолликулов 2-й степени атрезии (3-я группа) (табл. 3) резко возрастало число ооцитов, имеющих хромосомы с признаками дегенерации (деконденсация, фрагментация, слипание) на всех стадиях мейоза.
| Таблица 3. Динамика созревания ооцитов в фолликулах 2-й степени атрезии |
| Время культивирования, ч |
Число фолликулов |
Ооциты, % |
| диплотена |
метафаза I |
телофаза I - метафаза II |
| норма |
дегенерация |
норма |
дегенерация |
норма |
дегенерация |
| 0 |
90 |
44,4 |
37,8 |
2,2 |
2,2 |
10,0 |
4,4 |
| 6 |
38 |
39,8 |
34,4 |
10,1* |
5,0 |
5,0 |
5,7 |
| 12 |
40 |
20,0 |
30,0 |
20,0** |
10,0** |
20,0** |
- |
| 18 |
39 |
17,4 |
17,4 |
19,7** |
19,4** |
15,9 |
10,2* |
| 24 |
94 |
14,9 |
15,9* |
19,3** |
20,2** |
15,9 |
13,8* |
| 30 |
47 |
14,0 |
3,6** |
5,9 |
35,3* |
23,6** |
17,6** |
| 36 |
46 |
7,5* |
26,0 |
- |
16,8** |
16,6** |
33,3** |
| 42 |
43 |
3,8* |
40,8 |
- |
- |
13,4 |
42,0** |
| Примечание. Звездочками отмечены достоверные различия по отношению к контролю (время культивирования 0 ч): * p<0,05; ** p=0,01. |
Таким образом, культивирование интактных фолликулов (1-я группа) и фолликулов 1-й степени атрезии (2-я группа) не сопровождается проявлениями атретических процессов, в то время как при культивировании фолликулов 2-й степени атрезии (3-я группа) наблюдается усиление признаков дегенерации хромосом на всех стадиях мейоза.
Далее...
Написать комментарий
|
