Получение и характеристика мутантов Saccharopolyspora erythraеа, устойчивых к хлорамфениколу

Львовский государственный университет им. И.Франко, Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых препаратов, Москва

В начало...

Таким образом, в геноме СМ^r-мутантов S.erythraea 5 обнаружены две различные (18 и 70-78 т.п.н.) амплифицирующиеся последовательности. Однако мы не обнаружили корреляции между этими амплификациями и нестабильностью признака СМ^r у S.erythraea. Можно предположить, что наблюдаемые нами амплификации - это вторичные мутационные изменения, возникающие в геноме нестабильных мутантов, как это ранее описано у S.coelicolor A3 (2) [9].

Для локализации мутаций устойчивости S.eryhtraea к СМ проведены скрещивания с использованием в качестве родительских штамма ВТСС 4608 ura1 leu1 cmlR45⁺ и штамма 2407 met1 trp3 phe1 cmlR45. Мутант cmlR45 устойчив к 20 мкг/мл антибиотика. Проанализированы 4 класса гаплоидных рекомбинантов, образовавшихся в скрещиваниях: leu1⁺phe1⁺, leu1⁺trp3⁺, leu1⁺met1⁺ и ura1⁺met1⁺. Частота их возникновения составляла соответственно (6,0 0,4)?10^-4, (3,9 0,1)?10^-3, (7,5 0,5)?10^-5 и (5,9 0,5)?10^-4. В табл. 3 и на рис. 2 представлены результаты анализов генотипов 169 leu1⁺phe1⁺- и 200 ura1⁺met1⁺-рекомбинантов. Градиент аллельных отношений генетических маркеров, обнаруженный при этом, подобен таковому в других скрещиваниях S.erythraea [10]. В обоих случаях по этому градиенту мутация cmlR45 может находиться в хромосоме S.erythraea как между маркерами ura1 и met1 (позиция 1), так и между маркерами leu1 и trp3 (позиция 2) (см. рис. 2). Как видно из табл. 3, для образования ряда рекомбинантов необходимы множественные кроссинговеры при обоих положениях cmlR45. Если же эта мутация находится между ura1 и met1, то такие кроссинговеры нужны для возникновения значительно меньшего числа рекомбинантов, чем при второй ее позиции. Поэтому на основании критерия минимума множественных кроссинговеров, требуемых для образования рекомбинантов, позицию 1 мутации cmlRI следует считать предпочтительной. Полученные данные (см. табл. 3, рис. 2) указывают на отсутствие корреляции между наследованием аллелей cmlR45⁺/cmlR45 и других неселектируемых маркеров, что, в свою очередь, свидетельствует об отсутствии тесной сцепленности между ними. Следует отметить, что мутация хлорамфениколоустойчивости локализуется в том же районе хромосомы S.erythraea, что и детерминанты рифампициноустойчивости и биосинтеза эритромицина [10, 11].

Таблица 3. Селективный анализ потомства, полученного в скрещивании штаммов S.erythraea 4608 ura1 leu1 cmlR45+ и 2407 met1 trp3 phe1 cmlR45.
А. Селектируемые маркеры: leu1+ и phe1+ (рис. 2A)
Генотипы peкoмбинантов*				Число	Kроссинговер в интервале генетической карты для двух позиций cm1R45**
ura1	met1	trp3	cm1R45		I	II
+	+	+	+	33	2,7	2,7
+	+	+	cml	57	3,7	2,6
ura	+	+	+	8	1,7	1,7
ura	+	+	cml	1	1,2,3,7	1,6
+	met	+	+	2	2,3,4,6	4,7
+	met	+	cml	2	4,7	4,6
+	+	trp	+	30	2,5	3,5,6,7
+	+	trp	cml	23	3,5	2,5
ura	met	+	+	2	1,3,4,7	1,2,4,7
ura	met	+	cml	2	1,2,4,7	1,2,4,6
+	met	trp	+	4	2,3,4,5	4,5,6,7
+	met	trp	cml	2	4,5	4,5
ura	+	trp	cml	1	1,2,3,5	1,5
ura	met	trp	cml	2	1,2,4,5	1,3,4,5
Всего:				169

Б. Селектируемые маркеры: ura1+ и met1+ (рис. 2Б)
Генотипы peкoмбинантов*				Число	Kроссинговер в интервале генетической карты для двух позиций cm1R45**
leu1	trp1	phe1	cm1R45		I	II
+	+	+	+	1	2,7	2,7
+	+	+	cml	17	3,7	2,6
leu	+	+	+	2	1,2	1,2
leu	+	+	cml	11	1,3	1,2,6,7
+	trp	+	+	5	2,5	3,5,6,7
+	trp	+	cml	23	3,5	2,5
+	+	phe	+	16	2,4,5,6	2,4,5,7
+	+	phe	cml	11	3,4,5,6	2,4,5,6
leu	+	phe	+	2	1,2,4,5	1,2,4,5
leu	+	phe	cml	3	1,3,4,5	1,2,4,5,6,7
+	trp	phe	+	22	2,4	2,4,6,7
+	trp	phe	cml	66	2,4	3,4
leu	trp	+	+	6	1,2,5,6	1,2,5,6
leu	trp	phe	+	2	1,2,4,6	1,2,4,6
leu	trp	phe	cml	13	1,3,4,6	1,2,4,7
Всего:				200

Примечания: * Знаком "+" обозначены дикие аллели;
** Обозначения интервалов генетической карты приведены на рис. 1.

Рис. 2. Локализация мутации cmlR45 в скрещивании S.erythraea 4608 ura1 leu1 cmlR45+ ? 2407 metI trp3 pheI cmIR45. Селектируемые маркеры (обозначены треугольниками): А - leu1+ и phe1+; Б - ura1+ и met1+. Внешнее кольцо - хромосома штамма 2407 cmlR45, внутреннее кольцо - хромосома штамма 4608 cmlR45+. Цифры у каждого из аллелей соответствуют частоте (в %) их проявления среди анализируемой группы рекомбинантов.

Таким образом, введение мутаций хлорамфениколоустойчивости в геном S.erythraea позволяет увеличить изменчивость этой культуры по многим признакам, в том числе и по уровню биосинтеза эритромицина, что является одним из важнейших факторов в селекционной практике.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N3, стр.

ЛИТЕРАТУРА

2. Настасяк И.Н. Получение и характеристика мутаций у штаммов Saccharopolyspora erythraea,влияющих на биосинтез антибиотика эритромицина: Дис. ... канд. биол. наук. М.: 1992.

3. Davies J. Science 1994; 264: 375-382.

4. Cullum J., Altenbuchner J., Flett F., Plendi W. Biotechnol Gen Eng Rev 1986; 4: 59-79.

5. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова М.П., Максимова Т. С. Определитель актиномицетов. М 1983; 245.

6. Brown D.P., Ching S.-J.D., Tuan J.S., Katz L. J Bacteriol 1988; 170: 2287-2295.

7. Hopwood D.A. et al. Genetic Manipulation of Streptomyces. Norwich 1985; 356.

8. Заворотная С.А., Федоренко В. А., Стародубцева Л.И., Даниленко В.Н. Антибиотики и химиотер 1990; 12: 21-23.

9. Федоренко В. А., Стародубцева Л.И., Заворотная С.А. и др. Генетика 1989; 4: 626-634.

10. Настасяк И.Н.,Федоренко В. А., Даниленко В.Н. Антибиотики и химиотер 1997; 8: 14-20.

11. Weber J.M., Wierman C.K., Hutchinson C.R. J Bacteriol 1985; 104: 425-433.