|
Сазыкин Ю.О., Салова Т.В. Москва
В начало...
Описанный в 1976 г. как противогрибковый антибиотик и привлекший к себе внимание в конце 70-x годов благодаря иммуносупрессорным свойствам циклический ундекапептид циклоспорин А остается важнейшим для клиники иммуносупрессором природного происхождения, воздействующим на клеточную иммунную систему. Широкое применение циклоспорина А при пересадке органов и тканей, а также при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний обусловливает постоянный интерес к механизму его действия как ингибитора сигнальной трансдукции. Особенно интенсивно ведется изучение его разнообразных эффектов на уровне межклеточных взаимодействий, вызываемых появлением чужеродного антигена.
Согласно современной концепции, если ее сформулировать в самом общем виде, циклоспорин А ингибирует активацию Т-хелперов и опосредованно - Т-цитотоксических клеток. При этом циклоспорин А подавляет образование и секрецию интерлейкина-2 и других лимфокинов, отвечающих за пролиферацию Т-цитотоксических лимфоцитов. Им подавляется экспрессия рецептора интерлейкина-2 как на Т-хелперных лимфоцитах, так и на предшественниках Т-цитотоксических лимфоцитов [1, 2].
Исследования в области механизма действия циклоспорина А на молекулярном уровне были начаты в середине 80-х годов. Была обнаружена внутриклеточная мишень циклоспорина А, которой оказался содержавшийся в цитозоле белок, названный циклофилином [3]. Белки - представители групп циклофилинов (15-17 кД) выявлены в клетках разных животных тканей, в простейших и в грибах, и, видимо, включены в систему трансдукции поступающих извне сигналов, на которые реагируют клетки разной специализации (не только клетки иммунной системы). Например, поскольку реагирующий с циклофилином циклоспорин А у некоторых грибов индуцирует диморфизм, возможно, что циклофилин связан и с этим явлением.
Принципиально важными следует признать два одновременно опубликованных в 1989 г. (в одном номере журнала) сообщения об идентичности циклофилина по аминокислотной последовательности ядерному белку - ферменту пептидил-пролил-цис-транс-изомеразе [4, 5]. Эта изомераза участвует в процессах свертывания молекул некоторых белков. В случае Т-лимфоцитов фермент включен в раннюю клеточную активацию. Активность фермента полностью подавляется циклоспорином А (в концентрации 0,1 мкМ).
Молекулярный механизм связывания циклоспорина А с циклофилинами, даже наиболее изученным среди них циклофилином А, остается недостаточно изученным. Об этом свидетельствует недавняя попытка картирования связывающего места циклофилина А с помощью синтезированных для этой цели частично перекрывающихся более чем 150 пептидов [6].
В норме выполнение своих функций в сигнальных системах циклофилин начинает с реагирования с кальцийнейрином. Последний является Са2+-кальмодулин регулируемой или Са2+-кальмодулин зависимой серин/треонин протеинфосфатазой - представителем одного из четырех классов фосфатаз, входящих, в свою очередь, в одно из 28 "подсемейств", на которые принято дифференцировать фосфатазы. В максимально активном состоянии этот фермент - гетеротример, построенный из каталитической субъединицы А (60 кД), регуляторной субъединицы В (19 кД) и кальмодулина. Субъединица В и кальмодулин хелатируют Са2+. Их вторичная структура оказалась сходной, однако эти белки заменить друг друга не могут [7]. Кальцийнейрин высококонсервативен и играет ключевую роль в биологических ответах клеток (животных тканей, растений, грибов) на разные внешние воздействия.
Ответ на внешние воздействия, связанный с сигнальной трансдукцией, начинается, как отмечено выше, с реагирования циклофилина с кальцийнейрином. Реагирование же с кальцийнейрином комплекса циклофилин-циклоспорин А ведет к инактивации кальцийнейрина [8]. Изучение самого механизма связывания такого комплекса с кальцийнейрином показало, что в связывание со стороны кальцийнейрина включена не каталитическая субъединица А, а регуляторная субъединица В. Это дает возможность предполагать, что субъединица А ингибируется аллостерическим путем.
Таким образом, наиболее общее возможное представление о мишени циклоспорина А будет следующим: циклофилин А - белок с пептидил-пролил-цис-транс-изомеразной активностью, распространенный во многих типах клеток, включенный (через кальцийнейрин) в превращение ядерных транскрипционных факторов в функционально активное состояние [9], с многообразными функциями на физиологическом уровне, определяемыми специализацией клетки млекопитающих или особенностями клетки, принадлежащей к низшим эукариотам. Выполнение своих функций в сигнальных системах циклофилин начинает с реагирования с кальцийнейрином - протеинфосфатазой. Ядерные транскрипционные факторы дефосфорилируются, проникают в ядро, реагируют с ДНК, активируя экспрессию генов, кодирующих цитокины (в клетках иммунной системы - лимфокины). Циклоспорин А, реагируя с циклофилином, опосредованно воздействует на кальцийнейрин и предотвращает в конечном счете "работу" генов, включенных в ответ клетки на те или иные внешние воздействия.
Большой интерес представляет то обстоятельство, что природные иммуносупрессоры макролидной структуры имеют свои мишени циклофилинового типа (макрофилины), что привело в последние годы к появлению в литературе обобщающего термина "иммунофилины". Сходству и различию молекулярных механизмов действия циклоспорина А, макролида FK 506 и макролида рапамицина посвящено быстро растущее в настоящее время число публикаций.
В заключение следует отметить, что идентификация мишени для циклоспорина А в клетках человека позволила получать в препаративных количествах рекомбинантные иммунофилины (в частности циклофилин А) и использовать их в системах поиска и отбора новых природных иммуносупрессоров. Принцип так называемого "тагитного (target - мишень) скрининга" может быть основан, например, на оценке способности веществ, находящихся в неочищенных спиртовых экстрактах из мицелия культур почвенных микроорганизмов, препятствовать связыванию с изолированным циклофилином А меченого циклоспорина А, т.е. конкурировать с ним за место связывания. Для этой же цели апробируются варианты метода твердофазного иммуноферментного анализа [10].
В целом, перспективность "тагитного скрининга" несомненна. В то же время оказалось, что связывание того или иного нового вещества с циклофилином А не всегда предотвращает тот каскад ответных реакций на чужеродный антиген, в который включен циклофилин А. Так, был выделен и изучен антибиотик, обративший на себя внимание в связи с высоким сродством к этой мишени, мало уступавшим сродству циклоспорина А, но резко отличающийся от него по структуре как представитель нового семейства цимбимицинов - цимбимицин А [10]. Оказалось, однако, что находясь в комплексе с циклофилином А, он не препятствовал последнему реагировать с кальцийнейрином таким образом, что кальцийнейрин - фосфатазная активность и последовательность остальных "каскадных" реакций не подавлялась (помимо этого, цимбимицины, видимо, плохо проникают в интактную животную клетку).
Другое исследование было проведено с иммунофилином FKBP12 - мишенью для макролида FK 506, рапамицина, аскомицинов и других иммуносупрессоров макролидной природы [11].
Среди 12000 штаммов микроорганизмов, проверенных с помощью метода "тагитного скрининга", был обнаружен штамм Micromonospora, продуцирующий семейство антибиотиков макролидной структуры, близких к уже известным аскомицинам. Эти антибиотики, получившие название антаскомицинов, также реагируют с FKBP12, и, видимо, сходны с макролидами-иммуносупрессорами по той части молекулы, которая связывается с этим белком. Однако антаскомицины не прерывали каскада специфических ответных реакций на сигнал извне, которые прерываются иммуносупрессорами; они не ингибировали образования интерлейкина-2 и т.п. [11].
Таким образом, отбор по критерию связывания с мишенью, но не по последствиям этого связывания, не может считаться достаточным и окончательным. С другой стороны, приведенные данные косвенно указывают на сложность структурно-функциональной организации иммунофилинов (циклофилинов, макрофилинов) и еще недостаточную изученность их реагирования с иммуносупрессорами на молекулярном уровне [2, 12].
АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N3, стр. 3-4.
1. Borel J.F. Pharmacology of cyclosporine (Sandimmune). IV Pharmacological properties in vivo. Pharmacol Rev 1989; 41: 3: 259-371.
2. Rehacek Z. The cyclosporines. Folia Microbiol 1995; 40: 1: 68-88.
3. Handschumacher R.E., Harding M.W., Rice J. et al. Cyclophilin: a specific cytosol binding protein for cyclosporine A. Science 1984; 226: 544-546.
4. Fisher G., Wittman-Liebold B., Liang K. et al. Cyclophilin and peptidyl-prolyl cis-trans isomerase and probable identical proteins. Nature 1989; 337: 6206: 476-478.
5. Takahashi N., Hayano Т., Suzuki M. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase is the cyclosporine A binding protein cyclophilin. Nature 1989; 337: 6206: 473-475.
6. Yamamoto К., Kurokawa N., Kadobayashi M. et al. Mapping of cyclosporine A binding sites in cyclophilin A by using synthetic peptides. Regul Pept 1995; 59: 1: 23-30.
7. Zhu D., Cardenas M.E., Heitman J. Myristoylation of calcineurin В is not required for function or interaction with immunophilin - immunosuppressant complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 1995; 270: 42: 24831-24838.
8. Zenke G., Baumann G., Wenger R. et al. Molecular mechanisms of immunosuppression by cyclosporine. Ann Acad Sci 1993; 4: 685: 330-335.
9. Park J., Yassen N., Hoyan P.O. et al. Phosphorylation of the transcription factor NFATp inhibits its DNA binding activity in cyclosporine A treated human B and T cells. J Biol Chem 1995; 270: 35: 20653-20659.
10. Fehr F., Quesninaux V.F.J., Sangler J.J. et al. Cembimicin F and B, two novel cyclophilin-binding structures isolated from actinomycetes. J Antibiot 1997; 50: 11: 893-899.
11. Fehr F. Sangler J.J., Schuler W. et al. Antascomicins A, B, C, D and E novel FKBP12 binding compounds from a Micromonospora strain. J Antibiot 1996; 49: 3: 230-233.
12. Waldimarsson H. Mechanism of action of cyclosporine A J Immunol Today 1994; 15: 5: 247.
Написать комментарий
|
