Антимикробная и мембранолитическая активность экранированных фенолов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Институт химической физики РАН, Москва

В начало...

Нарушение проницаемости мембран интактных клеток другого чувствительного микроорганизма S.aureus определяли по увеличению поглощения клетками актиномицина D под действием данных экранированных фенолов (табл. 2). Ранее было показано [15], что мембранотропные антибиотики стимулируют поглощение актиномицина D клетками S.aureus 209P. Наши исследования показали, что ди-трет.бутильные производные резорцина и пирокатехина увеличивают поглощение актиномицина D клетками золотистого стафилококка. Поглощение антибиотика не изменялось под действием незамещенных соединений и находилось на уровне контроля (поглощения антибиотика без добавления экранированных фенолов) при испытанных концентрациях. Степень поглощения актиномицина D интактными клетками стафилококка под действием производных пирокатехина и резорцина находилась на уровне мембранотропного антибиотика грамицидина S [15].

Таблица 2. Влияние экранированных фенолов и их незамещенных аналогов на поглощение актиномицина D интактными клетками S.aureus 209P
Препараты	Kонцентрация препаратов, мкг/мл	Поглощение актиномицина D, мкг/мл
		10 мин	60 мин
Актиномицин D (контроль)	6,0	0,6	1,2
+ резорцин	10	0,6	1,4
	20	0,8	1,2
+ 4,6-ди-трет.бутилрезорцин	10	1,4	2,3
	20	2,0	2,5
+ пирокатехин	10	0,6	1,2
	20	0,6	1,4
+ 3,5-ди-трет.бутилпирокатехин	10	1,8	2,3
	20	2,0	2,3
+ 3,6-ди-трет.бутилпирокатехин	10	1,9	2,2
	20	1,9	2,3

Производные пирокатехина и резорцина не вызвали нарушения проницаемости мембран интактных клеток устойчивой бактерии E.coli (данные не приводятся).

Сделано предположение, что антимикробная активность пространственно-затрудненных фенолов связана с их мембранотропными свойствами. Для подтверждения этого изучалось действие производных пирокатехина и резорцина непосредственно на целостность цитоплазматической мембраны (протопласты и сферопласты) чувствительных и устойчивых бактерий. Результаты изучения литической активности данных соединений в отношении протопластов чувствительной бактерии B.megaterium представлены на рис. 2.

Рис. 2. Лизис протопластов B.megaterium при действии производных пирокатехина и резорцина в сравнении с незамещенными соединениями в течение 30 мин. По оси абсцисс - концентрация препаратов, мкг/мл; по оси ординат - изменение мутности суспензии протопластов (D540) в присутствии препаратов по сравнению с контролем (без препарата), %. 1 - 4,6-ди-трет.бутилрезорцин; 2 - 3,5-ди-трет.бутилпирокатехин; 3 - 3,6-ди-трет.бутилпирокатехин; 4 - резорцин, пирокатехин.

Обнаружен лизис протопластов B.megaterium в присутствии производных пирокатехина и резорцина. Как показано на рисунке, степень литической активности производного резорцина выше, чем у производных пирокатехина. Полный лизис протопластов производным резорцина происходил при концентрации 20 мкг/мл, производными пирокатехина - при концентрации 30 мкг/мл. Кроме того, лизис протопластов зависел не только от концентрации исследуемых соединений, но и от времени их воздействия. Производные пирокатехина и резорцина в концентрации 10 мкг/мл не обладали заметным литическим действием на протопласты через 15- 30 мин. Однако через 60 мин контакта 4,6-ди-трет.бутилрезорцин в этой концентрации вызывал лизис 60% протопластов, 3,5-ди-трет.бутилпирокатехин - 41%, 3,6-ди-трет.бутилпирокатехин - 18%. Незамещенные пирокатехин и резорцин (в пределах до 500 мкг/мл) не обладали литическим действием в отношении протопластов.

Производные пирокатехина и резорцина не проявляли литическую активность в отношении сферопластов устойчивой к ним бактерии E.coli (данные не приводятся).

В наших исследованиях спектр антимикробного действия изучаемых экранированных фенолов совпал с мембранотропными свойствами данных соединений. По-видимому, мишенью действия активных фенольных соединений на бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Возможность взаимодействия экранированных фенолов с цитоплазматической мембраной, видимо, зависит от их способности проникать к мембране через клеточную стенку бактерий. Нарушение проницаемости и целостности цитоплазматической мембраны чувствительных бактерий ведет к потере ими ряда внутриклеточных соединений и в конечном итоге их гибели.

Различия в степени антимикробной активности ряда пространственно-затрудненных фенолов обусловлен, вероятно, различиями химической структуры этих соединений. При сравнении моно- и ди-трет.бутильных фенольных соединений выявлено, что большей антимикробной активностью в отношении грамположительных бактерий обладали ди-трет.бутильные производные пирокатехина и резорцина. По-видимому, две гидроксильные группы и два ди-трет.бутильных заместителя у ароматического кольца молекулы обеспечивают этим соединениям высокую антимикробную активность. Установлено, что поверхность бактериальной клеточной стенки несет неравномерно распределенный отрицательный заряд [17, 18]. Незамещенные молекулы пирокатехина и резорцина в использованном буфере (рН 7,4) более ионизированы, чем их замещенные производные и, следовательно, в меньшей степени связываются с отрицательно заряженной клеткой. Следствием этого является, видимо, низкая активность этих соединений. Известно, что боковые цепи экранированных фенолов обеспечивают их связывание с липидными компонентами биологических мембран [19]. Введение одной или двух трет.бутильных групп в молекулу заметно увеличивает ее липофильность и, по-видимому, за счет увеличения связывания с клеткой происходит увеличение антимикробной активности экранированных фенолов.

Устойчивость E.coli к активным в отношении грамположительных бактерий экранированным фенолам, по-видимому, объясняется барьерными свойствами сложноструктурированной клеточной стенки этого микроорганизма и различием структуры липидного состава самой цитоплазматической мембраны E.coli и исследованных грамположительных бактерий. Даже обработка клеток кишечной палочки лизоцимом и ЭДТА при получении сферопластов не устраняет их устойчивости к производным пирокатехина и резорцина.

Таким образом, обладая антиоксидантными свойствами в отношении эукариотических клеток, проявляющимися в стабилизации клеточных мембран, и одновременно антимикробной активностью против грамположительных бактерий, синтетические экранированные фенолы могут использоваться в качестве эффективных терапевтических препаратов для лечения ожоговых поражений и других раневых инфекций.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1998-N8, стр. 11-15.

ЛИТЕРАТУРА

2. Wills E., Wilkinson A. Biochem J 1966; 99: 657-666.

3. Кияшко А.А. Нарушения гомеостаза и их корреляция у обожженных. Киев 1980; 126.

4. Arturson J. Symposium on the Early Тreatment of Burns: Abstr. Praha 1980; 2.

5. Кузьменко И.В., Клименко Е.П., Алексеев С.М. и др. Биол мембраны 1985; 2: 6: 557-565.

6. Заец Т.Л., Бурлакова Е.Б., Музыкант Л.И., Евсеенко Л.С. Бюлл экспер биол и мед 1983; 10: 29-32.

7. Вишнякова А.А. Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. М 1983; 89.

8. Ершов В.В., Никифоров Г.А., Володькина А.А. Пространственно-затрудненные фенолы. М 1972.

9. Белостоцкая И.С., Комиссарова Н.Л., Джуарян Э.В., Ершов В.В. Изв АН СССР; Сер химия 1972; 7: 1594.

10. Вольева В.Б., Белостоцкая И.С., Кармилов А.Ю. и др. Изв РАН; Сер Химия 1996; 6: 1499.

11. Белостоцкая И.С., Вольева В.Б., Комиссарова Н.Л. и др. Там же 1997; 7: 1328-1336.

12. Булгакова В.Г., Петрыкина З.М., Полин А.Н. Микробиология 1982; 51: 5: 838-842.

13. Birdsell D.C., Cota-Robles E.H. Bacteriol 1967; 93: 427.

14. Булгакова В.Г., Кострова О.А., Сазыкина С.Ю. и др. Антибиотики и химиотер 1989; 6: 425-429.

15. Булгакова В.Г., Орлова Т.И., Грушина В.А., Полин А.Н. Там же 1996; 7-8: 13-17.

16. Хохлов А.П., Ярыгин К.Н., Бурлакова Е.Б. Биол мембраны 1989; 6: 2: 133-141.

17. Sonnenfeld E.M., Beveridge T.J. J Bacteriol 1985; 163: 3: 1167-1171.

18. Sonnenfeld E.M., Beveridge T.J. Can J Microbiol 1985; 31: 875-877.

19. Кухтина Е.Н., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. и др. ДАН СССР 1983; 272; 3: 729-735.