Научная Сеть >> .Выделение и идентификация культур рода Mycobacterium антагонистов фитопатогенной микрофлоры

Наука >> Медицина | Научные статьи

Выделение и идентификация культур рода Mycobacterium - антагонистов фитопатогенной микрофлоры

Н.В. Козловская, И.О. Обгольцева, Е.П. Яковлева

Химико-фармацевтическая академия, Санкт-Петербург

Из природных субстратов выделен ряд сапрофитных бактерий и проведена их идентификация. Большая часть выделенных бактерий относилась к культурам рода Mycobacterium. Установлено, что при применении разработанной ранее тест-системы, включающей обработку почвенных субстратов щелочью и применение оптимальных питательных сред, преимущественно выделяются сапрофитные микобактерии. Первичные исследования показали, что культуры рода Mycobacterium обладают антифунгальными свойствами и могут служить перспективными объектами для скрининга антагонистов фитопатогенов.

Ключевые слова:

сапрофитные микобактерии, скрининг антагонистов фитопатогенов.

Биологический контроль грибных и бактериальных инфекций овощей и фруктов, находящихся на длительном хранении, является сравнительно новой и многообещающей отраслью научных исследований. Микробиологические препараты на основе высокоэффективных штаммов в отличие от синтетических препаратов, таких как пестициды, менее токсичны, быстро разлагаются, не приводят к накоплению их в пищевых продуктах и к аллергическим реакциям, дешевы и удобны в промышленных масштабах применения.

Всесторонние исследования в области биологического контроля привели к положительным практическим результатам при длительном хранении различных овощей и фруктов.

Антагонистическими свойствами в отношении фитопатогенов обладают различные микроорганизмы: бактерии родов Pseudomonas, Acremonium, Enterobacter, Bacillus, дрожжи.

Мало исследованы в этом отношении грамположительные нокардиоформные культуры. Сведения об антагонистической активности этих бактерий в отношении фитопатогенов в литературе крайне ограничены. Относительно противогрибковых антибиотиков, синтезируемых культурами рода Mycobacterium, известно, что антибиотик, выделенный из культуры сапрофитного штамма Mycobacterium species, подавляет рост отдельных видов грамотрицательных фитопатогенных бактерий, дерматофитов и дрожжеподобных грибов рода Candida [1].

Учитывая высокую антагонистическую активность различных видов микобактерий, при более тщательном изучении возможно обнаружение среди них высокоактивных в отношении фитопатогенов штаммов, синтезирующих антибиотики.

Ранее сообщалось о разработке тест-системы для проведения направленного скрининга продуцентов антибиотиков широкого спектра действия среди нокардио- и коринеформных бактерий [5]. Было показано, что в результате использования этой тест-системы преимущественно выделяются культуры, относящиеся к роду Mycobacterium.

Настоящее исследование посвящено выделению и изучению бактерий рода Mycobacterium на наличие у них антибиотиков, активных в отношении фитопатогенов.

Материал и методы

Для выделения культур рода Mycobacterium применяли щелочную обработку почвенных образцов Ленинградской области [7], которую проводили следующим образом: 6 - 7 г почвы растирали в ступке, вносили в 100 мл жидкой питательной соево-глюкозной среды с хлоридом кобальта (N 20/3), инкубировали в течение 6 ч при 28?С на качалке с n = (220 10) об/мин. Затем добавляли равные объемы 4% едкого натра и 0,2% малахитового зеленого. После выдерживания в течение 30 мин, нейтрализации и центрифугирования осадок высевали в чашки Петри с агаризованной средой N 20/3. Выросшие колонии изолировали на косяки с той же средой.

Идентификацию выделенных почвенных бактерий проводили с использованием методов, предложенных в определителе бактерий Берги [3] и в монографии О.А. Нестеренко и соавт. [4]. Мазки окрашивали по Граму и по Циль-Нильсену [2].

Для изучения роста выделенных культур в жидкой питательной среде использовали мясо-пептонный бульон (МПБ). Рост микроорганизмов в МПБ описывали, используя 4-7-суточные культуры, выращенные в стационарных условиях [2].

Определение способности исследуемых культур к восстановлению нитратов выявляли на МПБ с 0,5% КNO₃, способность к гидролизу крахмала - на мясо-пептонном агаре (МПА), содержащем 0,2% крахмала, при дальнейшей обработке его раствором Люголя [8].

Каталазную активность исследуемых культур выявляли при помощи 4% раствора перекиси водорода. Культуральные свойства штаммов изучали у 2-4-суточных колоний на агаризованной соево-глюкозной среде N 20/3 с хлоридом кобальта.

Для скрининга антагонистов фитопатогенов был использован в качестве тест-культуры гриб Fusarium solani, выделенный со стебля огурца. Штамм предоставлен научно-исследовательской лабораторией кафедры общей холодильной технологии Санкт-Петербургского технологического института холодильной промышленности.

Посевы сапрофитных микобактерий инкубировали при 28?С в течение 2-4 суток. Тест-культуру фитопатогенного гриба выращивали на агаризованной среде N 71 (пивное сусло) при 28?С в течение 7 суток до появления хорошего опушенного роста.

Первичный отбор антагонистов фитопатогенов проводили методом агаровых блоков [2]. Суспензию тест-культуры фитопатогена вносили в расплавленный агар и разливали его в чашки Петри. На поверхность агара после его застывания помещали агаровые блоки, вырезанные с газона исследуемой культуры бактерии. Газон бактериальной культуры получали, используя МПА. Чашки с агаровыми блоками инкубировали 7 суток при 28?С, контролировали зоны задержки роста тест-культуры через 2, 4 и 7 суток. Суспензию тест-культуры фитопатогена вносили в среду из расчета 0,2 мл на 100 мл. Суспензию готовили, добавляя 10 мл дистиллированной воды в пробирку с тест-культурой, выращенной на 10-15 мл скошенной агаризованной среды.

В качестве культуры сравнения использовали ранее выделенный и идентифицированный в лаборатории N 1 Всесоюзного научно-исследовательского технологического института антибиотиков и ферментов медицинского назначения штамм Mycobacterium sp. 53.

Результаты и обсуждение

Выделение микобактерий проводили селективным методом с учетом их кислотоустойчивости, а также чувствительности сопутствующей микрофлоры к селективным агентам.

Тест-система для направленного выделения из почвенных субстратов продуцентов антибиотиков широкого спектра действия среди нокардиоформ включает создание специфических условий выделения бактерий (обработку почвенных субстратов щелочью и малахитовым зеленым), применение оптимальных агаризованных и жидких питательных сред. Соблюдение всех перечисленных условий приводит к преимущественному выделению из почвенных образцов бактерий рода Mycobacterium [5, 6].

Была использована система для выделения микобактерий, проявляющих антагонистическое действие в отношении фитопатогенов. При этом было выделено несколько сотен колоний, которые были сгруппированы на основании морфолого-культуральных признаков в 16 групп, после чего изолированы на косяки со средой N 20/3. Далее было проведено детальное изучение морфологических и культуральных свойств выделенных 16 штаммов микроорганизмов.

При микроскопии исследуемых культур обнаружилось, что предварительно их можно разделить на три группы.

В первую отнесли один штамм 7/4, который представлял собой грамположительную споровую культуру.

Во вторую отнесли шесть штаммов: 3/4, 6/4, 9/4, 13/4, 14/4, 16/4, которые представляли собой грамотрицательные мелкие палочки.

Третью группу составили девять штаммов: 1/ 4, 2/4, 4/4, 5/4, 8/4, 10/4, 11/4, 12/4, 15/4, которые по морфологическим признакам предположительно можно было отнести к культурам рода Mycobacterium.

У девяти штаммов, отнесенных в третью группу, выявлено наличие характерного полиморфизма и цикла развития "кокк - палочка - кокк", а также вариабельность окраски по Граму. Установлено, что молодые палочковидные клетки грамположительны, однако по мере перехода в кокковидную стадию их реакция по Граму становится менее отчетливой. Отмечена способность культур врастать в плотные среды и образовывать пленки на поверхности МПБ.

Наличие свойства кислотоустойчивости - один из дифференцирующих признаков родов нокардиоформных бактерий [4]. Установлено, что молодые палочковидные клетки исследуемых 9 штаммов свойством кислотоустойчивости, как правило, не обладали. Однако при переходе культур в кокковидную фазу роста кислотоустойчивость зрелых клеток становилась очевидной. В таблице представлены результаты идентификации выделенных почвенных культур.

Таблица. Идентификация культур, выделенных из почвенных субстратов

Штамм Kислото- и спиртоустойчивость Восстановление нитратов Гидролиз крахмала Наличие каталаз Рост на МПБ Соответствие фазам роста "кокк - палочка - кокк" Реакция по Граму

1/4, 8/4 + + + Пленка + +

2/4, 4/4, 5/4, 10/4, 12/4, 15/4 + + + - Пленка + +

11/4 + + + + Пленка + +

3/4 - + + + Kольцо - -

9/4, 16/4 - + + + Пленка, среда мутная - -

6/4 - + - Среда мутная - -

7/4 - - + Пленка, среда мутная - +

13/4 - + + Пленка - -

14/4 - + - + Пленка - -

Mycobacterium sp. 53 + + + + + + +

Все перечисленные выше морфологические и культуральные свойства почвенных бактерий являются необходимыми признаками родов группы нокардиоформ. Предложенная тест-система приводит к преимущественному выделению сапрофитных микобактерий, а не нокардий и родококков. Изучение свойств 9 исследуемых штаммов показало, что они обладают признаками и свойствами, аналогичными свойствам контрольного штамма Mycobacterium sp. 53, что позволило нам не проводить дальнейшую идентификацию бактерий и отнести их, на основании вышеуказанных признаков, к роду Mycobacterium.

Первичный отбор антагонистов фитопатогенов вели среди 9 выделенных штаммов, а также 5 музейных штаммов рода Mycobacterium (M.parafortuitum 806, M.vadosum, M.jiliforme, M.ladicolum BKMB-461, M.lacticolum 854), а культуру Mycobacterium sp. 53 использовали в качестве контрольной, так как ранее было установлено, что она обладает антибиотической активностью в отношении фитопатогенов.

Агаровые блоки с выросшими на них исследуемыми штаммами помещали на чашки Петри со средой N 71, в которую был внесен тест-организм. При наличии антагонистических свойств у бактерий зона вокруг блока оставалась свободной от роста тест-культуры. Если же при этом в среду выделялось биологически активное вещество, то отмечалась зона задержки роста и штамма исследуемой культуры.

На рисунке представлены результаты исследования первичной антагонистической активности штаммов. Анализ полученных результатов показывает, что все выделенные культуры обладают активностью в отношении фитопатогенов. А музейные штаммы микобактерий активностью в отношении фитопатогенов не обладают.

Антагонистическая активность исследуемых культур микобактерий.
По оси абсцисс - номера штаммов; по оси ординат - зоны задержки роста фитопатогенного гриба Fusarium solani, мм.

Таким образом, установлено, что в результате применения тест-системы преимущественно выделяются культуры рода Mycobacterium, обладающие антагонистической активностью в отношении фитопатогенов.

Выводы

1. Из природных субстратов выделен ряд сапрофитных бактерий, проведена их идентификация и установлено, что большая часть относится к культурам рода Mycobacterium.

2. Показано, что при применении разработанной ранее тест-системы преимущественно выделяются сапрофитные микобактерии, активные в отношении фитопатогенов.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1998-N6, стр. 20-23.

ЛИТЕРАТУРА

1. Айзенман Б.Г. Антибиотические свойства бактерий. Киев 1973; 183.

2. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М 1976; 307.

3. Краткий определитель бактерий Берги/Под ред. Дж. Хоулта: Пер с англ. М 1980; 495.

4. Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. Киев 1985; 334.

5. Обгольцева И.О., Кузнецова О.С., Яковлева Е.П. Некоторые методические подходы к направленному скринингу продуцентов антибиотиков среди коринеформных бактерий. Антибиотики и химиотер 1991; 8: 6-10.

6. Обгольцева И.О., Кузнецова О.С., Яковлева Е.П. Таксономическая характеристика почвенных микобактерий и изучение их антибиотичексих свойств. Там же 11: 5-8.

7. Обгольцева И.О. Направленный поиск продуцентов антибиотиков среди грамположительных неспорообразующих бактерий: Автореф дис ... канд биол наук 1992; 201.

8. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев 1990; 263.

Антибиотики и химиотерапия

Написать комментарий