|
Т.В. Мосунова, Е.П. Яковлева Химико-фармацевтическая академия, Санкт-Петербург.
В начало...
Исследована способность бактериальных культур трансформировать нуклеозиды в виразол - рибозид, обладающий противовирусным действием. Подобраны качественный и количественный методы оценки активности микроорганизмов в реакции биотрансформации. Разработан метод качественного экспресс-анализа большого количества культур. Проверено 39 коллекционных штаммов на способность к биоконверсии нуклеозидов в виразол. В качестве источника фермента - пуриннуклеозидфосфорилазы в реакции использовали интактные клетки, выращенные на жидкой питательной среде. В качестве донора рибозы были проверены пуриновые нуклеозиды - аденозин, инозин, гуанозин, а также 30% раствор рибозы, полученный при гидролизе рибоксина. Наилучшие результаты получены при использовании раствора рибозы. Четкой корреляции между родовой принадлежностью микроорганизма и его способностью к биоконверсии определенных субстратов не выявлено. Выявлено несколько культур, показавших стабильные и высокие результаты со всеми испытанными субстратами.Ключевые слова:
Методы современной микробиологической трансформации позволяют использовать для осуществления реакций практически любые микроорганизмы. На практике число культур, используемых в процессе биотрансформации, ограничено рядом условий. В первую очередь находят применение сапрофиты, способные развиваться на достаточно простых и дешевых питательных средах, гетеротрофы, обладающие интенсивным обменом веществ.
Поиск наиболее активного штамма, осуществляющего определенную реакцию, является достаточно сложным и трудоемким процессом. Решающую роль здесь могут сыграть случайные обстоятельства - имеющийся в распоряжении микробиолога набор микроорганизмов, изученность данных культур, условия их выращивания и т.д.
Для проведения многих трансформаций могут быть использованы обычные коллекционные культуры. Этот способ наиболее оправдан, если энзиматические превращения, интересующие исследователя, осуществляются ферментами обычного клеточного метаболизма. Вместе с тем некоторые исследователи отдают предпочтение диким, свежевыделенным штаммам, отмечая их высокую активность [1].
Виразол (рибавирин) является синтетическим рибозидом, родственным по своей структуре природным нуклеозидам, обладающим противовирусным действием. В литературе описаны химические и микробиологические способы его получения [2-4]. Основным ферментом биосинтеза виразола является нуклеозидфосфорилаза, которая относится к ферментам метаболизма нуклеотидов и широко распространена среди различных групп бактерий [5-7].
Задачей данного исследования была отработка методов качественной и количественной оценки активности нуклеозидфосфорилазы и поиск наиболее активных штаммов в реакции биотрансформации нуклеозидов в виразол.
Клетки бактерий выращивали глубинным способом в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл в течение 24 ч при 28?С на круговой качалке (220 об/мин). Каждая колба содержала 100 мл питательной среды N 116 сложного состава, содержащей глюкозу, лактозу, крахмал, а также кукурузный экстракт и БВК. Влажную биомассу клеток собирали центрифугированием при 3000 g в течение 15 мин, осадок промывали и подвергали центрифугированию при тех же условиях.
Реакционная смесь содержала 20 ммолей нуклеозида, 20 ммолей 1,2,3-триазол-3-карбоксамида (ТСА) и 25 ммолей дигидрофосфата калия, растворенных в 1 мл воды. К реакционной смеси добавляли клеточную биомассу из 10 мл культуральной жидкости. Смесь инкубировали в течение 24 ч при 65?С.
По окончании реакции смесь центрифугировали, надосадочную жидкость исследовали с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии (ТСХ) [8-11].
В случае бумажной хроматографии исследуемые растворы наносили на хроматографическую бумагу, которую помещали в хроматографическую камеру с подобранной нами оптимальной системой растворителей: бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (50:25:25). Через сутки бумагу вынимали, высушивали, пятна веществ обнаруживали в УФ-свете и идентифицировали сравнением с положением пятен образцов-свидетелей и элюировали 0,1 н. соляной кислотой. Оптическую плотность элюатов измеряли на спектрофотометре СФ-26. Концентрации веществ рассчитывали, используя известные коэффициенты молярной экстинкции. Значения Rf аденозина и виразола составили в указанной системе 0,6 и 0,4 соответственно.
В случаях ТСХ образцы растворов наносили на пластины "Silufol-UV254" ("Kavalier") и помещали в систему растворителей метанол - вода (3:1). Пятна обнаруживали в УФ-свете, а также с помощью специального реактива. Для этого опрыскивали пластину свежеприготовленным раствором, состоящим из анисового альдегида, метанола и серной кислоты (5:85:10) [10]. Затем ее нагревали при 110?С в течение нескольких минут. В местах локализации виразола и нуклеозидов обнаруживали четкие серо-зеленые пятна. По интенсивности окрашивания этих пятен судили о содержании вещества. Значения Rf аденозина и виразола составили в указанной системе 0,77 и 0,86 соответственно.
Основной реакцией процесса биотрансформации нуклеозидов в виразол является перенос рибофуранозного остатка с донора-нуклеозида на ТСА, осуществляемый нуклеозидфосфорилазой. В качестве донора рибозы могут быть использованы различные вещества, но чаще используются пуриновые и пиримидиновые нуклеозиды [5-7]. В данной работе были использованы пуриновые нуклеозиды - аденозин, гуанозин и инозин, а также раствор рибозы, полученный путем гидролиза рибоксина.
На первом этапе работы были проверены коллекционные культуры на способность к биоконверсии нуклеозидов в виразол. Проанализировав литературные данные, мы включили в перечень культур, представляющих интерес для исследования, микроорганизмы родов Arthrobacter, Brevibacterium, Bacillus, Сorynebacterium, Erwinia, Xanthomonas и др., которые были получены из ВКМ и ВНИИГЕНЕТИКА. Полученные результаты приведены в таблице.
| Таблица. Способность коллекционных штаммов бактерий к трансформации нуклеозидов в виразол |
| N п/п |
Штамм |
Виразол, мг/мл |
| Г |
И |
А |
Р |
| 1 |
Achromobacter agile BKM B-525 |
1,70 |
2,30 |
1,90 |
2,20 |
| 2 |
A.epsteinii BKM B-56 |
2,10 |
1,30 |
1,80 |
3,0 |
| 3 |
A.liquefaciens BKM 96 |
1,32 |
0,64 |
1,50 |
1,50 |
| 4 |
A.liquefaciens BKM 97 |
1,60 |
0,20 |
1,56 |
1,70 |
| 5 |
Arthrobacter aurescens BKM B-653 |
1,70 |
1,64 |
2,06 |
2,0 |
| 6 |
A.citreus BKM AC-1106 |
1,88 |
1,72 |
2,04 |
1,20 |
| 7 |
A.duodecadis BKM AC-1108 |
1,80 |
2,28 |
2,10 |
3,20 |
| 8 |
A.globiformis BKM- B-660 |
1,40 |
1,68 |
0,60 |
1,80 |
| 9 |
A.simplex BKM B-667 |
1,80 |
1,82 |
2,60 |
1,90 |
| 10 |
A.tumescens BKM AC-1120 |
2,06 |
1,12 |
2,10 |
3,50 |
| 11 |
Aureobacterium sp. BKM B-1202 |
1,70 |
2,0 |
1,82 |
2,30 |
| 12 |
Bacillus brevis BKM B-487 |
1,70 |
1,32 |
2,30 |
3,20 |
| 13 |
B.brevis BKM B-503 |
1,50 |
1,28 |
2,60 |
3,20 |
| 14 |
B.brevis BKM B-677 |
1,48 |
1,32 |
1,30 |
2,32 |
| 15 |
B.brevis BKM B-678 |
1,30 |
1,06 |
1,30 |
1,60 |
| 16 |
B.cereus BKM B-370 |
1,65 |
1,83 |
2,10 |
2,10 |
| 17 |
B.cereus BKM 680 |
1,32 |
1,05 |
2,0 |
1,30 |
| 18 |
B.cereus BKM 682 |
1,70 |
1,38 |
2,48 |
1,80 |
| 19 |
B.cereus BKM 684 |
0,98 |
1,92 |
2,10 |
2,0 |
| 20 |
Brevibacterium ammoniagenes ИМФ 225-5 |
0,85 |
1,20 |
0,80 |
1,60 |
| 21 |
B.ammoniagenes ИМФ AP-13 |
1,20 |
2,0 |
0,40 |
2,10 |
| 22 |
B.ammoniagenes УМФ 25/27 |
0,96 |
1,26 |
1,80 |
1,93 |
| 23 |
B.citreum BKM B-1207 |
1,70 |
1,38 |
2,48 |
3,50 |
| 24 |
B.imperiale BKM B-1204 |
0,98 |
1,92 |
2,10 |
2,0 |
| 25 |
B.luteum BKM B-1210 |
1,50 |
1,66 |
1,30 |
1,80 |
| 26 |
Corynebacterium variabilis BKM AC-1122 |
1,40 |
0,80 |
2,0 |
2,40 |
| 27 |
Curtobacterium albidum BKM B-1206 |
1,05 |
1,32 |
2,70 |
1,80 |
| 28 |
C.lineus BKM 1209 |
1,0 |
1,30 |
2,70 |
3,0 |
| 29 |
Erwinia avoideae BKM B-566 |
2,0 |
0,56 |
2,30 |
2,20 |
| 30 |
E.carotovora BKM B-567 |
1,50 |
1,96 |
2,20 |
3,10 |
| 31 |
E.herbicola BKM B-1203 |
1,30 |
0,92 |
2,10 |
2,40 |
| 32 |
Escherichia coli BKM B-60 |
1,20 |
1,70 |
2,50 |
1,85 |
| 33 |
E.coli BKM B-125 |
1,68 |
1,72 |
2,30 |
1,90 |
| 34 |
E.coli BKM B-841 |
1,72 |
1,96 |
2,40 |
2,0 |
| 35 |
Sarcina lutea BKM B-110 |
2,10 |
1,40 |
1,82 |
2,20 |
| 36 |
Serratia marcescens BKM B-1059 |
1,09 |
1,68 |
2,16 |
2,20 |
| 37 |
Xanthomonas campestris BKM B-610 |
1,76 |
2,16 |
2,58 |
3,70 |
| 38 |
X.campestris BKM B-611 |
1,30 |
2,0 |
2,80 |
2,20 |
| 39 |
X.campestris BKM B-570 |
1,80 |
2,0 |
2,10 |
2,80 |
Примечание. Буквами в таблице обозначены доноры рибозы: Г - гуанозин, И - инозин, А - аденозин, Р - 30% раствор рибозы.
Согласно литературным данным, количество образовавшегося в ходе реакции биотрансформации виразола варьирует в широких пределах в зависимости от многих факторов - условий реакции, используемого донора рибозы, микроба-трансформанта и, конечно, соотношения компонентов реакционной смеси [5-7]. Поскольку во всех публикациях указанные выше параметры реакции микробной трансформации существенно разнятся друг от друга, то их трудно сравнивать между собой и оценивать конечный результат. Нами за усредненный показатель количества виразола, образовавшегося в реакции, была использована величина 2,0 0,2 мг/ мл виразола или 40% конверсии ТСА, так как условия реакции, при которых были достигнуты эти значения, наиболее сходны с условиями в наших экспериментах [7].
Как видно из результатов, приведенных в таблице, все коллекционные культуры в той или иной степени обладали способностью к конверсии нуклеозида в виразол.
При использовании в качестве донора рибозы гуанозина активность культур была невысокой. Только 4 штамма из 39 образовывали больше 2 мг/мл виразола. Это A.epsteinii шт. B-56 - 2,10 мг/мл, A.tumescens шт. AC-1120 - 2,06 мг/мл, E.avoideae шт. B-566 - 2,0 мг/мл и S.lutea шт. B-110 - 2,10 мг/мл. Среднее значение для всех исследованных культур не превышало 1,3-1,5 мг/мл виразола.
При использовании инозина в качестве рибозидного донора результаты также были не очень высокими. Средний уровень биоконверсии для всех культур составил 1,5-1,7 мг/мл. Более 2,0 мг/мл виразола синтезировали лишь 7 штаммов. Это A.agile шт. B-525 - 2,30 мг/мл, A.duodecadis шт. AC-1108 - 2,28 мг/мл, Aureo-bacterium sp. шт. B-1202, B.ammoniagenes шт. AP-13, X.campestris шт. B-611 и B-570 - по 2,0 мг/ мл, X.campestris шт. B-610 - 2,16 мг/мл.
Аденозин, используемый в качестве источника рибозы в реакции микробной трансформации, явился наилучшим из трех проверенных нами нуклеозидов. Так, более 60% исследованных культур способствовали синтезу виразола в количестве не меньше 2,0 мг/мл. Следует отметить высокие концентрации виразола в случае представителей рода Arthrobacter: 5 из 6 штаммов были высокоактивными, лишь для A.globiformis шт. В-660 показатели были невысокими - 0,6 мг/мл виразола. Представители рода Bacillus также проявили хорошую способность к трансформации аденозина в виразол. Все четыре штамма B.cereus обеспечивали образование виразола в концентрации выше 2,0 мг/мл, а B.cereus шт. 682 - 2,48 мг/мл. Сходные результаты получены для B.brevis. Штаммы В-677 и В-678 проявили меньшую активность - концентрация виразола достигала 1,3 мг/мл, у 2 других штаммов отмечали более высокие активности - B.brevis шт. В-487 - 2,3 мг/мл, а шт. В-503 - 2,6 мг/мл. Также следует отметить высокую способность к синтезу у С.albidum и C.lineus - по 2,7 мг/мл. Представители E.coli также образовывали более 2 мг/мл варизола: штамм В-60 - 2,5 мг/мл, В-125 - 2,3 мг/мл, а В-841 - 2,4 мг/мл виразола.
Особо следует отметить результаты, полученные в реакции микробной трансформации с культурами рода Xanthomonas. Все они образовывали более 2,0 мг/мл виразола, а у шт. В-611 отмечали накопление этого соединения в концентрации до 2,8 мг/мл.
В то же время представители рода Brevibacterium, которые по литературным данным являются одними из наиболее активных и универсальных микробов-трансформантов, не проявили достаточной активности в реакции микробной трансформации нуклеозидов. У трех штаммов B.ammoniagenes - 225-5, AP-13 и 25/27 - накапливалось менее 2,0 мг/мл виразола. B.luteum также не явилась активным трансформантом аденозина, она образовывала всего 1,3 мг/мл. Лишь у двух культур - B.imperiale и B.citreum - накапливалось более 2,0 мг/мл виразола, что позволило нам считать их достаточно активными продуцентами.
Несомненно, наилучшим источником рибозы является гидролизат рибоксина, поскольку в реакцию вступает чистая рибоза. В этом случае были получены наиболее высокие значения выхода виразола. Более 60% культур проявляли высокую активность в реакции биоконверсии нуклеозидов, причем 9 штаммов образовывали виразол в количестве до 3 мг/мл и выше. Например, A.tumescens - 3,5 мг/мл, B.citreum - 3,5 мг/мл, X.campestris шт. 610 - 3,7 мг/мл. Среднее значение по всем исследуемым культурам составило 2,2-2,5 мг/мл.
Как следует из представленных в таблице данных, проследить определенную закономерность способности к трансформации нуклеозидов в виразол у различных родов бактерий оказалось достаточно сложно. Четкой корреляции между родовой принадлежностью микроорганизма и его способностью к биоконверсии определенных субстратов мы не наблюдали. Одни и те же штаммы могли проявлять высокую ферментативную активность с одним субстратом и низкую - с другим. Например, разброс данных у B.ammoniagenes шт. АР-13 колебался от 0,7 мг/мл виразола, если в качестве субстрата использовали аденозин, до 2,1 мг/мл при использовании гидролизата рибоксина.
В то же время некоторые культуры показали достаточно стабильные и высокие результаты со всеми испытанными субстратами: A.duodecadis шт. AC-1108, X.campestris шт. 610, 611, 570, B.citreum шт. B-1207, Aureobacterium sp. шт. 1202, A.agile шт. B-525 проявляли высокую способность к конверсии нуклеозидов в виразол.
Таким образом, среди коллекционных культур были определены наиболее активные штаммы микроорганизмов, обеспечивающие трансформацию нуклеозидов в виразол, перспективные для дальнейших исследований.
АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1998-N4, стр. 3-6.
1. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. М 1976; 336.
2. Дудчик Н.В., Зинченко А.И., Барай В.Н. и др. Изв АН БССР 1990; 5: 90-95.
3. Utagawa F., Morisawa H., Jamanaka S. et al. Agric Biol Chem 1985; 49: 11: 3239-3246.
4. Witkowski J.T., Robins R.K., Sidwell R. et al. J Med Chem 1972; 15: 11: 1150-1154.
5. Eur Pat No. 0307853, 1988.
6. Ibid; N 0093401, 1983.
7. Ibid; N 0307854, 1988.
8. Ерошевская Л.А., Барай В.Н., Зинченко А.И. и др. Антибиотики 1986; 3: 174-178.
9. Попов И.Л., Барай В.Н., Зинченко А.И. и др. Там же 1985; 8: 588-591.
10. Хроматография в тонких слоях/Под ред Э. Шталя. М 1965; 508.
11. Справочник биохимика: Пер с англ/Досон К. и др. М 1991; 544.
Написать комментарий
|
