Сравнительная характеристика иммунотропных препаратов из кожи

О.В. Белова, В.Я. Арион, И.В. Зимина, Ю.М. Лопухин, О.Б. Сысоева, Т.А. Луканидина, М.Н. Некрасова

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РФ, Москва

В начало...

Было изучено влияние препаратов на количество АОК селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа. Данные представлены на рис. 2 А.

Рис. 2. Влияние препаратов из кожи свиньи на количество антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей линии СВА на пике первичного иммунного ответа. А - метод с высаливанием; Б - метод без высаливания. П1, П2, П3 - препараты N1, N2 и N3.

Как видно из представленных данных, препараты П2 и П3 увеличивали количество АОК во всех исследованных дозах (1, 10 и 100 мкг/мышь). Различия с контролем достоверны по критерию Стьюдента. Препарат П1 достоверно увеличивал количество АОК лишь в дозе 100 мкг/мышь. Максимальный эффект оказывал препарат П2 в дозе 10 мкг/ мышь (процент АОК составлял 180%). Поскольку АОК являются потомками В-лимфоцитов, можно говорить о стимулирующем влиянии препаратов на В-систему иммунитета.

Мы изучили влияние препаратов на восстановление чувствительности фРОК селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна. Данные представлены на рис. 3 А.

Рис. 3. Влияние препаратов из кожи свиньи на восстановление чувствительности фоновых розеткообразующих клеток (фРОК) селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна. А) - метод с высаливанием; Б) - метод без высаливания. П1, П2, П3 - препараты N1, N2 и N3.

Как видно из представленных данных, активными в данном тесте оказались все три препарата.

Препараты N1 и N3 были активными в концентрации 20 мкг/мл, а препарат N2 - в концентрации 10 мкг/мл: процент фРОК для них был ниже 50%.

Тест восстановления чувствительности к азатиоприну применяется рядом исследователей для оценки активности тимических факторов [13]. Тимэктомия приводит к резкому снижению чувствительности фРОК селезенки, образующих розетки с эритроцитами барана, к азатиоприну, что связано с уменьшением количества зрелых Т-лимфоцитов. Тимические факторы восстанавливают это свойство, способствуя созреванию Т-клеток. В настоящем исследовании препараты из кожи восстанавливали чувствительность к азатиоприну, что говорит об их возможном влиянии на дифференцировку Т-клеток.

Затем мы сравнили физико-химические свойства препаратов, полученных двумя различными методами. В табл. 1 приведено сравнительное содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов в препаратах, полученных разработанным ранее методом без высаливания и новым методом. Содержание белка, определяемое биуретовым методом, во всех трех препаратах, полученных методом с высаливания, выше по сравнению с препаратами, имеющими ту же молекулярную массу, а содержание углеводов и общих липидов ниже. Содержание белка по Лоури в П1 и П2, полученных методом с высаливанием, также выше, тогда как его содержание по Лоури в П3, полученном методом с высаливанием ниже, чем без высаливания. Разница в содержании белка в П3, определяемого по биурету и по Лоури составляет 1,6 раза для метода без высаливания и 8,6 раза для метода с высаливанием. Вероятно, П3, получаемый методом с высаливанием, еще более обеднен пептидами, содержащими определенную аминокислотную последовательность, которая дает максимальное окрашивание по методу Лоури [14].

Проведено сравнение содержания РНК в препаратах, полученных двумя методами. Как видно из представленных данных, содержание РНК в препаратах N2 и N3, полученных путем высаливания, гораздо меньше, чем в препаратах с аналогичными молекулярными массами, полученных без высаливания. Содержание РНК в П2 уменьшилось в 4,5 раза, а в П3 - в 7 раз, в то время как его содержание в П1 имеет тенденцию к увеличению, хотя различия недостоверны (р > 0,05).

Таким образом, введение этапов высаливания в метод получения привело к изменению физико-химических свойств препаратов: увеличилось содержания белка в препаратах с аналогичной молекулярной массой, уменьшилось содержания углеводов и общих липидов; значительно сократилось содержание РНК в препаратах N2 и N3 и достоверно не изменилось их содержание в препарате N1.

Мы сравнили иммунологические свойства препаратаов, полученных двумя различными методами.

На рис. 2 (А, Б) приведен сравнительный анализ влияния препаратов, полученных обоими методами, на количество АОК селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа. Активность препаратов, имеющих одинаковую молекулярную массу, но полученных различными методами, отличается. Максимальной активностью в данном тесте обладает препарат N3, полученный без высаливания и препарат N2, полученный с высаливанием. Кроме того, изменяется характер зависимости активности от дозы. Если П2, полученные методом без высаливания при дозе 10 мкг/мл имеют минимальную активность, то П2 с высаливанием - максимальную. П1 без высаливания имеет максимальную активность при дозе 10 мкг/мл, в то время как П1 с высаливанием - при дозе 100 мкг/мл.

Активность препаратов, полученных различными методами, также отличается в тесте восстановления чувствительности фоновых РОК тимэктомированных мышей к ингибирующему действию аазатиприна (рис. 3 А, Б). Из препаратов, полученных методом без высаливания, активностью в данном тесте обладал лишь П3, в то время как среди препаратов, полученных методом с высаливанием, активны все три. Препарат N3, полученный методом без высаливания, активен в концентрации 10 мкг/мл. Препарат N3, полученный методом с высаливанием, активен в концентрации 20 мкг/мл.

Выводы:

1. Разработан новый метод получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи, включающий этапы высаливания. Этим методом были выделены три препарата с теми же молекулярными массами, что и и ранее выделенные препараты.

2. Изучены физико-химические свойства препаратов: определено содержание белка, РНК, углеводов и общих липидов.

3. Изучены некоторые иммунологические свойства: показано, что все три препарата увеличивают количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа и восстанавливают чувствительность фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна .

4. Проведен сравнительный анализ физико-химических и иммунологических свойств препаратов, полученных двумя методами: без высаливания и с высаливанием. Он показал, что введение высаливания сульфатом аммония привело к изменению физико-химических свойств препаратов, имеющих одинаковую молекулярную массу: увеличилось содержания белка в препаратах и уменьшилось содержания РНК, углеводов и общих липидов.

5. Введение этапов высаливания привело к увеличению иммунологической активности: препараты N1 и N2 стали проявлять активность в тесте восстановления чувствительности фоновых РОК селезенки тимэктомированнх мышей к ингибирующему действию азатиоприна. Изменился характер зависимости активности всех трех препаратов от дозы в методе Ерне.

Иммунопатология, аллергология, инфектология, N2-2001, с.15-21.

Литература

1. Арион В.Я., Белова О.В., Орлова В.Ф., Капитанов А.Б., Лопухин Ю.М. Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека. Бюл. изобрет. 1995; N 18: 24.

2. Арион В.Я., Белова О.В., Луканидина Т.А., Сысоева О.Б., . Дворцова В.В., Бреусов Ю.Н. Иммунологические свойства препаратов из кожи. Бюлл. экспер. биол. мед. 2000; Т.129; N 2: 194-7.

3. Арион В.Я., Белова О.В.. Иммунологически активные препараты из кожи (обзор собственных данных). Inter. Jor. Immunorehab. 2000; Vol. 2; N 1: 33-6.

4. Белова О.В., Арион В.Я., Лопухин Ю.М. и др. Получение и свойства фракций из кожи, влияющих на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека. Rus. J. Immun. 1999; Vol. 4; N 2: 151-7.

5. Лопухин Ю.М., Арион В.Я., Иванова В.Ф., Белова О.В., Капитанов А.Б. Биологически активные вещества кожи, влияющие на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека. Бюл. экспер. биол. 1992; Т. 114; N. 11: 473-5.

6. Лопухин Ю.М., Воронцова Е.М., Белова О.В. и др. Способ лечения псориаза. Бюл. изобрет. открыт. 1997; N 20: 25.

7. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; Vol. 193: 265-75.

8. Gornall A.C., Bardawill C.J., David M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. Biol. Chem. 1949; Vol. 177: 751-66.

9. Seifter S. A method for the detection of carbo-hydrates by the anthrone reagent. Arch. Biochem. 1950; Vol. 25: 191-3.

10. Schmidt G., Tannhauser S.J. A method for the detection of desoxyribonucleic acid, ribonucleic acid and phosphoproteins in animal tissues. J. Biol. Chem. 1945; Vol. 161: 83-9.

11 . Zollner N., Kirsch K. On the quantitative determination of lipids (micromethod) by means of the general sulfophosphovanillin reaction of the many natural lipids (all known plasmalipids). Zeitschrift fur gesamte experimentell Medizin. 1962; Vol. 135: 545-61.

12. Зигль Э., Бем Э. Метод локального гемолиза в геле. В кн.: Иммунологические методы. - М.; 1979: 96-107.

13. Dardenne M., Bach J.-F. The sheep cell rosette assay for the evaluation of thymic hormones. In: Biologycal activity of thymic hormones. Eds. V. Bekkum, D.W.Rotterdam. N.Y.; 1975: 235-43.

14. Бейли Д. Определение белка. Методы химии белков. М.; 1965: 266