|
О.В. Белова, В.Я. Арион, И.В. Зимина, Ю.М. Лопухин, О.Б. Сысоева, Т.А. Луканидина, М.Н. Некрасова Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РФ, Москва
В начало...
В разработанный ранее метод получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи были введены этапы высаливания сульфатом аммония. На основе нового метода были выделены три препарата с теми же молекулярными массами, что и препараты, полученные методом, разработанным ранее. Определено содержание белка, РНК, углеводов и общих липидов. Изучены некоторые иммунологические свойства препаратов: все три препарата увеличивали количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа и восстанавливали чувствительность фоновых розеткообразующих клеток (РОК) селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна.
Проведен сравнительный анализ физико-химических и иммунологических свойств препаратов, полученных двумя методами: без высаливания и с высаливанием. Показано, что введение процедуры высаливания сульфатом аммония привело к изменению физико-химических свойств препаратов с аналогичными молекулярными массами: увеличению содержания белка в препаратах и уменьшению содержания РНК, углеводов и общих липидов. Введение этапов высаливания способствовало получению новых иммунологических свойств. Так, препарат N1 (молекулярная масса более 15 кДа) и препарат N2 (молекулярная масса от 1,4 до 15 кДа) стали проявлять активность в тесте восстановления чувствительности фоновых РОК селезенки тимэктомированнх мышей к ингибирующему действию азатиоприна, в то время как препараты с аналогичными молекулярными массами, выделенные методом без высаливания, такой активности не проявляли. Изменился характер зависимости активности всех трех препаратов от дозы в методе Ерне.
Ключевые слова:
Одной из перспективных проблем прикладной иммунологии является разработка и создание новых иммунотропных препаратов. Ранее авторами данной статьи был разработан метод выделения иммуноактивных препаратов из кожи свиньи [1]. Используя этот метод, были выделены три препарата, изучены их физико-химические свойства, показано их влияние на некоторые иммунологические параметры, а также на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре. [2, 3, 4, 5]. Было показано, что препарат с молекулярной массой от 1,4 до 15 кДа может быть с успехом использован для лечения псориаза [6]. Изучение физико-химических свойств препаратов показало, что все они, помимо белков и углеводов, содержат РНК. Для получения более чистых белковых препаратов мы ввели этапы высаливания сульфатом аммония в разработанный ранее метод.
Целью данной работы было: выделить препараты из кожи свиньи новым методом, включающим этапы высаливания сульфатом аммония; изучить их физико-химические и некоторые иммунологические свойства; провести сравнительный анализ физикохимических и иммунологических свойств препаратов, полученных двумя методами: без высаливания и с высаливанием.
Метериалы и методы. В метод получения препаратов из кожи свиньи, разработанный ранее [1, 2, 4], мы ввели этапы высаливания сульфатом аммония - один из широко применяемых способов очистки белков. "Ацетоновый порошок" получали по методу, разработанному ранее [1, 4]. Затем его растворяли в 0,01М трис-НСl буфере pH 8,0 при комнатной температуре и центрифугировали при 10000g в течение 20 мин. при 4оС. Осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 3:1 при 4оС. Нерастворимую часть удаляли центрифугированием при 10000g в течение 50 мин. при 4оС. Доводили pH супернатанта до 4,0 с помощью 10% раствора уксусной кислоты. Затем добавляли сухой сульфат аммония при постоянном помешивании из расчета: 14,6 г - на 100 мл супернатанта и 30 г - на 100 мл уксусной кислоты, перемешивали при комнатной температуре и центрифугировали при 12000g в течение 30 мин. при 4оС. Супернатант сливали, осадок гомогенизировали в 0,01М трис НСl рН 8,0. Затем насыщенный раствор сульфата аммония прикапывали к гомогенату в ледяной бане в соотношении 1,5:1 и центрифугировали при 18000g в течение 30 мин. при 4оС. Супернатант сливали, осадок гомогенизировали в минимальном объеме 0,01М трис-НСl + 0,15М NaCl pH 8,0 и центрифугировали при 18000g в течение 30 мин. при 4оС. Осадок отбрасывали, а супернатант наносили на колонку 2,5х100 см с сефадексом G-50 с маркерами: голубым декстраном и DNP-L-аланином. Собирали три фракции с теми же молекулярными массами, что и разработанным ранее методом без высаливания [1], обессоливали и лиофилизировали.
В препаратах определяли содержание белка по методу Лоури [7] и биуретовым методом [8], содержание углеводов - антроновым методом [9], РНК - по Шмидту и Таннгаузеру [10] и общих липидов - сульфофосфованилиновым методом [11].
Количество антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей СВА на пике первичного иммунного ответа определяли по методу Ерне [2,12]. Эритроциты барана вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл физиологического раствора в концентрации 400 млн/мл. Одновремнно подкожно вводили испытуемые препараты в дозе 1, 10 и 100 мкг на мышь. На пятые сутки животных забивали, выделяли селезенку и подсчитывали число зон гемолиза в чашках Петри. Определяли процент АОК по отношению к контролю, принимая среднюю арифметическую в контрольной группе за 100%. Все результаты соотносили со средней арифметической в контрольной группе.
Восстановление чувствительности фоновых розеткообразующих клеток (фРОК) селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна определяли по методу Баха [13]. Мышей-самцов С57Bl/6 тимэктомировали в возрасте 6-7 недель для создания модели частичного иммунодефицита по Т-системе иммунитета и брали в опыт через 2-8 недель после операции. Получали суспензию клеток селезенки.
В опытные пробы помимо азатиоприна добавляли испытуемые препараты до конечной концентрации 1, 5, 10, 20, 50 и 100 мкг/мл. Подсчитывали количество фРОК селезенки тимэктомированных мышей на 104 ядросодержащих клеток. Результаты выражали в процентах фРОК по формуле: А=(Мо : Мк) х100%, где А - процент фРОК; Мк - средняя арифметическая фРОК в контроле; Мо - то же самое в опыте.
Активными считали фракции, для которых процент фРОК (А) был менее 50%. Для сравнения активности препаратов определяли минимальную концентрацию, при которой препарат проявлял активность.
Достоверность различий между выборками оценивали с использованием непарного параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического критерия Вилкинсона-Манна-Уитни.
Результаты исследования
Профиль элюции супернатанта, полученного новым методом, включающим этапы высаливания, на колонке с сефадексом G-50 представлен на рис. 1. Собирали фракции с теми же молекулярными массами, что и фракции, полученные методом без высаливания: фракция N1 - молекулярная масса более 15 кДа (препарат N1, П1 ), фракция N2 - от 1,4 до 15 кДа (препарат N 2, П2) и фракция N3 - менее 1,4 кДа (препарат N3, П3).
 |
| Рис. 1. Профиль элюции супернатанта на колонке с Сефадексом G-50. ГД - голубой декстран (2000 кДа), ДНФ - ДНФ-аланин (255 Да). П1, П2, П3 - препараты N1, N2 и N3. |
Определяли содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов. Данные представлены в табл. 1. Как видно из представленных данных, содержание белка падает от П1 к П3, в то время как содержание углеводов нарастает. Содержание РНК колеблется в пределах от 1,2 до 3,2%, а содержание общих липидов от 0,5 до 1,9%. Надо отметить, что содержание белка в препаратах N1 и N2, определяемое методом Лоури и биуретовым методом, практически не отличается между собой.
| Таблица 1. Процентное содержание белка, углеводов, РНК и общих липидов (М м) в препаратах из кожи, полученных двумя методами: с высаливанием и без высаливания |
| Номера препаратов |
Методы |
P1 |
P2 |
P3 |
| Белок (биуретовый метод) |
Высаливание |
97 2,9 |
83 11 |
25 7,4 |
| без высаливания |
87 7,3 |
56 6,0 |
15 2,0 |
| Белок (метод Лоури) |
Высаливание |
98 3,3 |
76 15 |
2,9 0,3 |
| без высаливания |
91 2,9 |
51 3,2 |
8,2 1,1 |
| Углеводы |
Высаливание |
0,51 0,06 |
3,9 0,2 |
5,9 1,8 |
| без высаливания |
0,74 0,30 |
8,0 1,4 |
9,0 2,7 |
| РНК |
Высаливание |
3,2 0,6 |
1,2 0,4 |
2,0 1,1 |
| без высаливания |
2,0 0,4 |
5,4 1,0 |
14 2,4 |
| Общие липиды |
Высаливание |
1,9 0,5 |
0,5 0,2 |
1,0 0,7 |
| без высаливания |
2,2 0,1 |
1,4 0,3 |
1,4 0,2 |
В то же время его содержание в П3, определяемое биуретовым методом, в 8,6 раз больше, чем по методу Лоури (различия достоверны, p >0,95). Биуретовый метод отличается точностью, выход по окраске мало меняется от белка к белку, т.к. реактив взаимодействует с пептидной цепью [14]. При изучении метода Лоури было установлено, что любая пептидная связь дает некоторую окраску, но определенные последовательности аминокислот, и притом не обязательно содержащие ароматичнские остатки, дают более интенсивную окраску, чем другие; они и обусловливают главным образом окраску, развиваемую белком [14]. Поскольку методом Лоури мы выявляем гораздо меньше белка, чем биуретовым методом, можно предположить, что П3 не содержит эти определенные последовательности аминокислот. Можно также заключить, что биуретовый метод более полно выявляет белки, содержащиеся в П3.
Далее...
Написать комментарий
|
