Курсовая работа студента 4-го курса кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ.
Москва, 2001
Авторские права сохранены. Любое копирование данного текста и/или его фрагментов без разрешения автора запрещено и преследуется в соответствии с действующим законодательством РФ.

Содержание   В начало...
 
 

В настоящем разделе на примере генов aльфа-литической протеиназы и химотрипсинподобных протеиназ S. griseus показывается общий план устройства генов экзосекреторных протеиназ бактерий.

Необходимым условием для клонирования гена оказывается знание аминокислотной последовательности зрелого энзима. Это позволяет синтезировать набор олигонуклеотидных зондов, потенциально пригодных для выявления нужного клона методом гибридизации по Southern. При этом целесообразно учитывать так называемый codon bias - характерное для данного организма статистическое отклонение от равномерности в использовании кодонов. Последующее секвенирование позволяет провести всесторонний анализ структуры гена. В частности, именно так были получены косвенные данные, свидетельствующие о том, что aльфа-литическая протеиназа синтезируется в виде процессируемого предшественника. Его N-концевой участок, отщепляемый в ходе процессинга, является типичным, хотя и необычно крупным, пропептидом.

Подобным образом в работах [10, 27] удалось определить структуру гена aльфaльфа-литической протеиназы путем клонирования в E. coli. Клонированный ген aльфaльфа-литической протеиназы обладает высокой G+C встречаемостью (69.8% для кодирующей цепи и 68,4% для некодирующей). Наибольший уклон в G+C сторону наблюдается в третьих положениях кодонов. Ген содержит ORF для белка в 396 АКО. В рамке было обнаружено два потенциально инициаторных кодона AUG в положениях -198 и -207 upstream относительно последовательности зрелого энзима. Так как за 7 н. до -198го нуклеотида находится участок сильной гомологии с последовательностью Шайна-Дальгарно, то, вероятно, инициаторным является Met(-198).

Препроучасток содержит 198 кодонов. Предсказанная длина препептида по сиквенсу была оценена в 24 АКО [10] (что в целом совпадает со средним размером прокариотических лидерных последовательностей), а длина пропептида - соответственно в 174 АКО, что примерно в два раза больше обычного.

В параллельной работе [27] были получены более обширные данные, подтверждающие результаты работы [10]. Так, в частности, данные о существовании крупного N-концевого предшественника были подтверждены Northern-гибридизацией и S1-картированием. Согласно этим данным, мРНК aLP имеет длину в 1,4 т.п.н. и образует протяженную 5'-область перед нуклеотидной последовательностью, соответствующей зрелому ферменту. Как уже было указано выше, локализация в этой области как промоторной последовательности, так и последовательности Шайна-Дальгарно недвусмысленно указывает на трансляцию 5'-концевого участка мРНК в N-концевой процессирующийся участок белка. В работе [27] также были уточнены данные по размерам предшественника, так, длина препептида составляет 33 АКО, а пропептида - 166 АКО.

Поиск гомологии aLP с последовательностями других протеиназ выявил значительное сходство с секреторными протеиназами А и В из S. griseus [10], гены которых были клонированы к тому моменту [11]. Сходство зрелых функциональных частей этих ферментов (35% попарной гомологии aLP-A и aLP-B) отмечалось и раньше. За пределами зрелых последовательностей зона максимальной гомологии (21 и 38%) располагалась в C-концевой части пропептида. В то же время за -49-м аминокислотным остатком процент совпадающих остатков резко падал до 7 и 3% соответственно. Учтя корреляцию между внутрисемейным сходством четвертичных структур и пропептидов, авторы сделали вывод об основополагающей роли С-концевого участка в фолдинге aLP и даже не исключили возможность распространения пространственного сходства в сторону N-конца от области максимальной гомологии.

Интересной и в то же время характерной чертой явилось обнаружение гомологии между N-концевым участком препропоследовательностьи aLP длиной в 34 АКО и ингибитором трипсина из семян кукурузы размером 65 АКО. Это позволило авторам высказать идею об ингибиторных свойствах этого участка. Особый интерес, по их мнению, представляет попадание предсказанного сайта отщепления лидерного пептида в вышеуказанную область гомологии - естественно предположить, что таким образом осуществляется сопряжение экзосекреторного транспорта фермента с его активацией. В отличие от субтилизинов и протеиназ А и В, сайт отщепления пропептида у aLP не соответствует первичной субстратной специфичности зрелого фермента. Поэтому авторы предположили, что если активация aLP является аутокаталитическим процессом, как у вышеуказанных ферментов, то для обеспечения собственного процессинга фермент должен приобретать определенную энзиматически активную конформацию, проявляющую отличную от зрелого фермента специфичность.

Клонирование генов протеиназ SGPA и SGPB из S. griseus, ранее описанное в работе [11], подтвердило существование дифференцированной трифункциональной структуры у их предшественников. Размеры N-терминальных пропептидов составили 76 и 78 АКО соответственно. Основываясь на данных о первичной структуре пропептидов, авторы выдвинули ряд предположений об их функциях, аналогичных функциям достаточно хорошо изученного к тому времени пропептида субтилизина Е (см. ниже).

2.1.2. Сравнительный анализ структуры пропептидов

Таблица 1.Процент совпадающих остатков в последовательностях пропептидов бактериальных химотрипсиноподобных протеиназ семейства aльфа-литической протеиназы
	ALP	SGPE	SGPC	SGPD	SGPA	SGPB
ALP	100	31,4	26,8	29,3	23,0	36,5
SGPE		100	34,0	41,0	38,7	38,3
SGPC			100	33,1	42,9	49,7
SGPD				100	39,4	48,1
SGPA					100	49,0
SGPB						100
Использованные сокращения: ALP - aльфaльфа-литическая протеиназа L. enzymogenes, SGPE - глутамилэндопептидаза S. griseus, SGPA, SGPB, SGPC, SGPD -протеиназы A, B, C и D S. griseus.

В то время, как зрелые ферменты бактериальных химотрипсиноподобных протеиназ имеют существенное сходство в последовательностях и пространственной структуре, их пропептиды заметно отличаются друг от друга по размеру и первичной структуре (см. табл. 1). Так, пропептиды SGPA и SGPB идентичны по аминокислотной последовательности на 49%, в то время как их зрелые ферменты, состоящие из 181 и 185 остатков соответственно, содержат 62% совпадающих остатков [11]. Идентичность первичной структуры пропептида aльфaльфа-литической протеиназы и пропептидов SGPA и SGPB составляет соответственно 23% и 36.5%.

Поскольку SGPA и SGPB весьма сходны друг с другом по аминокислотной последовательности как в области зрелого фермента, так и в области пропептида (см. рис. 1), а положения их aльфа-углеродных атомов в значительной степени топологически эквивалентны, было бы интересно выяснить, может ли пропептид одного фермента взаимодействовать с протеиназным доменом другого. Для этого в работе [5] была получена конструкция с химерным геном, состоящим из пропептида SGPA и зрелого фермента SGPB. Поскольку при гетерологичной экспрессии химерной протеиназы в B. subtilis в культуральной жидкости было обнаружено 7% протеиназной активности зрелого SGPB, авторы сочли, что пропептид SGPA может в некоторой степени способствовать образованию секреторной активной формы SGPB, хотя эффективность этого взаимодействия, естественно, значительно ниже, чем в случае гомологичного пропептида.

Рис.1. Выравнивание аминокислотных последовательностей пропептидов бактериальных протеиназ семейства химотрипсина [26]. Символом I обозначены сайты отщепления пропептидов. Использованные сокращения: alp - aльфaльфа-литическая протеиназа L. enzymogenes, SGPE - глутамилэндопептидаза S. griseus, SGPA, SGPB, SGPC, SGPD -протеиназы A, B, C и D S. griseus. Консервативные блоки обозначены боксами.

Субтилизины выделены в отельное семейство сериновых протеиназ. К настояшему времени известно более 50 представителей этой группы, обнаруженных как у G+ и G- бактерий, так и у грибов и у высших Eukaryotae. Наиизученнейшими субтилизинами, безусловно, являются белки, секретируемые мезофильными видами рода Bacillus: субтилизин Е B. subtilis, субтилизин BPN' B. amyloliquefaciens, субтилизин Carlsberg B. liсheniformis. В частности, для них известны трехмерные структуры и секвенированы гены, благодаря чему они используются как модельные системы в белковой инженерии. Все субтилизины синтезируются в виде автопроцессирующихся пре-про-предшественников.

При анализе последовательности гена, кодирующего субтилизин Е B. subtilis [17, 18], оказалось, что экспрессионный продукт представляет собой предшественник функционального энзима, так называемый "препрофермент" и содержит в себе следующие структурно-функциональные подразделения (по порядку от N-конца): сигнальный пептид (препептид), состоящий из 29 аминокислотных остатков и необходимый для экскреции белка, пропептид, включающий 77 аминокислотных остатков и отщепляемый в результате процессинга профермента, и собственно зрелый субтилизин, состоящий из 275 аминокислот, обнаруживаемый в культуральной жидкости B. subtilis. Наличие пропептида различной длины между последовательностями сигнального пептида и зрелого фермента было характерно и для субтилизинов из других источников.

Последовательность препептида обладает характерными свойствами лидерных пептидов: несколькими положительно заряженными аминокислотными остатками сразу за N-концевым Met и длинной гидрофобной областью. Сайт процессинга сигнального пептида в препросубтилизине представляет собой последовательность Ala-Gln-Ala-Ala, которую можно считать канонической для секреторных бациллярных протеиназ. [34]

Анализ аминокислотной последовательности пропептида субтилизина Е позволяет выделить ряд его характерных особенностей:

(1) Заряженные аминокислоты составляют 36% всех остатков пропептида, что превышает их содержание в зрелом ферменте (12%);

(2) Распределение этих заряженных остатков крайне неравномерно; При нейральном pH на N-конце (от (-77) до (-51) остатка) находятся 7 положительно заряженных остатков, в то время как на С-конце пропептида (от (-16) до (-1)) пять отрицательно заряженных;

(3) Полярные нейтральные остатки Ser и Thr также распределены неравномерно - 7 из 10 этих остатков находятся внутри N-концевого 24-членного участка;

(4) Имеется единственный Pro в положении (-15);

(5) Можно выделить 3 коротких гидрофобных области (см. рис. 2.).

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей пропептидов субтилизинов [16]. А. Субтилизин Carlsberg Б. Субтилизин BPN` В. Субтилизин E 1. H1, H2, H3 - гидрофобные области I - сайт процессинга пропептида. U - стоп кодон.

Далее...