Курсовая работа студента 4-го курса кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ. Москва, 2001
Авторские права сохранены. Любое копирование данного текста и/или его фрагментов без разрешения автора запрещено и преследуется в соответствии с действующим законодательством РФ.

Содержание   В начало...
 
 

В настоящее время наиболее вероятными кандидатами на роль сенсоров считают группу из четырех консервативных белков: Rad1, Rad9, Hus9 и Rad 17. По своей структуре они схожи с белками комплекса репликации ДНК (рис.6) [17].

Рис. 6. Возможно, Rad1-Rad9-Hus1 и Rad17-RFC2-5 формируют комплексы, аналогичные репликационным комплексам PCNA и RFC1-5 (взято из [17]).

Rad1, Rad9 и Hus9 имеют высокий процент гомологии с фактором процессивности ДНК-полимеразы delta (PCNA). PCNA представляет собой гомотример в форме кольца, который может двигаться по ДНК подобно карабину, скользящему по веревке (sliding clamp).

Моделирование структуры дрожжевых Rad1, Rad9 и Hus9 показывает, что теоретически они могут формировать гетеротример в форме кольца, аналогичный гомотримерному PCNA [18], так называемый CLC (checkpoint sliding clamp). Экспериментально показано, что у человека при повреждениях ДНК Rad1, Rad9 и Hus1 объединяются в комплекс, при этом Rad9 фосфорилируется [19]. Дрожжевые Hus1 и Rad9 также фосфорилируются при повреждениях ДНК [17, 20]. Rad9 человека обладает 3'-5' экзонуклеазной активностью [21], известной у ДНК-полимераз, способных к исправлению ошибок репликации (proofreading).

Белок Rad17 гомологичен всем пяти субъединицам фактора репликации C (RFC) - p36, p37, p38, p40 и p140. В процессе репликации комплекс RFC1-5 "надевает" фактор процессивности (PCNA) на ДНК. Кроме того, некоторые субъединицы RFC участвуют в чекпойнте репликации ДНК.

Rad17 объединяется в комплекс с четырьмя меньшими субъединицами RFC. При возникновении повреждений ДНК Rad17-RFC2-5 погружает на ДНК комплекс белков Rad1-Rad9-Hus1, аналогично тому, как RFC1-5 погружает на ДНК фактор процессивности PCNA [22].

Несмотря на то, что эти белки в настоящее время активно изучаются, до сих пор нельзя с уверенностью приписать им роль сенсоров. Но даже если это так, вполне вероятно, что они далеко не единственные сенсоры в системе контроля повреждений ДНК. Возможно, в этой системе имеется множество сенсорных подсистем, каждая из которых реагирует на определенный тип повреждений [16].

4.2. Датчики: ATM и ATR

Центральное положение в системе контроля повреждений ДНК занимают два консервативных белка ATM и ATR. Эти белки, схожие между собой по структуре и функции, относятся к классу PI3K-белков. Фосфатидилинозит-3-OH-киназа (PI3K) играет важную роль в передаче сигналов. Помимо PI3K, к этому классу относят каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеинкиназы, участвующей в процессах негомологичной рекомбинации, V(D)J-рекомбинации генов иммуноглобулинов и сигнализации повреждений ДНК [23]. Сами ATM и ATR также являются протеинкиназами.

Индивидуумы, имеющие мутации в двух аллелях гена ATM, страдают тяжелым заболеванием атаксией-телеангиоэктазией (ataxia-telangiectasia). Это заболевание характеризуется нейродегенеративными процессами, иммунодефицитом и предрасположенностью к злокачественным новообразованиям.

В клетках, мутантных по гену ATM, нарушен ответ на ионизирующее излучение: не происходит остановка клеточного цикла как в G1, так и в G2, не приостанавливается синтез ДНК. В то же время, ATM, видимо, почти не участвует в реакции на действие ультрафиолета и алкилирующих агентов.

ATR необходим для развития организма. Клетки, гомозиготные по мутантному ATR, гибнут in vitro, при этом в их фенотипе наблюдается фрагментация хромосом [24]. Возможно, ATR является основным "контроллером" процесса репликации [16]. Мыши, у которых повреждена только одна аллель ATR, выживают, но имеют предрасположенность к злокачественным опухолям [24].

В связи с летальностью мутаций ATR-/- функции этого белка изучены менее подробно, чем ATM. Показано, что ATR активируется при любых повреждающих воздействиях на ДНК, в том числе при действии ультрафиолета и гидроксимочевины.

Каким именно образом активируются протеинкиназы ATM и ATR в ответ на повреждения ДНК, пока точно не известно. Имеющиеся данные позволяют сделать вывод, что, несмотря на схожесть этих белков, механизмы их активации различаются.

Эксперименты in vivo свидетельствуют, что киназная активность ATM проявляется при повреждениях ДНК [25, 26]. Однако до сих пор не выяснено, является ли ДНК непосредственным активатором ATM, или активация опосредована другими белками. Тем не менее, показано, что небольшие количества очищенного ATM способны связываться с ДНК in vitro.

Возможно, механизм связывания ATM c ДНК похож на связывание с ДНК каталитической субъединицы ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK) [16]. DNA-PK может связываться с ДНК в местах двунитевых разрывов, однако аффинность этого взаимодействия невелика. Взаимодействия становятся значительно более прочными, когда DNA-PK объединяется в комплекс с Ku-белками [22]. В интактной ДНК Ku-белки локализуются на теломерах, принимая участие в их стабилизации. При возникновении повреждений они направляются к местам разрывов и связываются с поврежденными участками.

Можно предположить, что для связывания ATM с поврежденными участками ДНК также необходимы определенные кофакторы, играющие роль сенсоров повреждений.

В отличие от ATM, киназная активность ATR не возрастает при повреждениях ДНК. Тем не менее, повреждения каким-то образом влияют на функционирование ATR, так как известно, что он фосфорилирует свои эффекторы p53 и Chk1 только при действии ионизирующего излучения (в случае p53) или ультрафиолета (Chk1) [16].

Возможно, при возникновении повреждений активируются какие-то сенсорные белки, которые способствуют связыванию эффекторов с ATR [16]. Подобный механизм "привлечения субстрата" (substrate recruitment) показан для ДНК-зависимого фосфорилирования чекпойнт-киназы Rad53 Saccaromyces cerevisiae с участием сенсора RAD9 (аналога Rhp9 S. pombe) [27].

4.3. Важнейшие эффекторы: чекпойнт-киназы, BRCA1 и p53

Датчики ATM и ATR распределяют сигнал по различным эффекторным белкам. Мы остановимся только на важнейших из них: чекпойнт-киназах Chk1 и Chk2, BRCA1 и знаменитом "страже генома" p53.

4.3.1. Чекпойнт-киназы Chk1 и Chk2

Чекпойнт-киназы Chk1 и Chk2 (другое название Cds1, аналог Rad53 S. cerevisiae) - это серин/треонин-киназы, негомологичные по структуре, но сходные по функциям и субстратам фосфорилирования. Возможно, чекпойнт-киназы, являются опухолевыми супрессорами. В биопсиях мелкоклеточного рака легкого находят мутантную форму Chk2 и минорную изоформу Chk1 [28].

При возникновении повреждений ДНК датчики ATM и ATR фосфорилируют Chk2, в результате чего происходит ее активация. Активированная Chk2, в свою очередь, фосфорилирует различные мишени, среди которых опухолевые супрессоры p53 и BRCA1, а также фосфатаза Cdc25С, играющая важную роль в регуляции G2-чекпойнта.

Так, Chk2 фосфорилирует p53 по Ser-15, "защищая" от атаки Mdm2. У клеток, мутантных по двум аллелям CHK2, нарушены p53-зависимые процессы, такие, как остановка в G1 и апоптоз [30]. Известны случаи синдрома Ли-Фраумени, вызванного мутациями в гене СHK2, а не p53 [31].

Chk2 колокализована в ядре с опухолевым супрессором BRCA1. Ионизирующее излучение активирует Сhk2, которая, в свою очередь, фосфорилирует BRCA1. При этом BRCA1 также активируется, что сопровождается его выходом из очагов локализации [32].

Chk2 ингибирует фосфатазу Cdc25С [33]. Видимо, в связи с этим клетки CHK2-/- не способны поддерживать остановку клеточного цикла в G2 (G2-arrest), хотя инициация G2-чекпойнта у них не нарушена [30].

В отличие от Chk2, активность чекпойнт-киназы 1 не увеличивается в ответ на повреждения ДНК. Тем не менее, показано, что при ДНК-повреждающих воздействиях Chk1 фосфорилируется датчиками ATR и, возможно, ATM [34]. Каким именно образом фосфорилирование Chk1 влияет на ее активность, до конца не выяснено. Предполагается, что в фосфорилированной форме Chk1 легче связывается со своими мишенями [16].

Функции Сhk1 изучены в меньшей степени, чем Chk2, поскольку мутации CHK1-/- летальны. Мыши, нокаутированные по двум аллелям CHK1, умирают в раннем эмбриогенезе из-за p53-независимого апоптоза эмбриональных стволовых клеток. Тем не менее, удалось показать, что клетки CHK1-/- не способны к остановке клеточного цикла в G2 [34].

Имеются данные, что Сhk1 фосфорилирует p53 in vitro [35]. Однако имеет ли место этот процесс in vivo, пока неизвестно. In vivo выявлено, что p53 при участии опухолевых супрессоров p21^waf1 и pRb способен действовать как ингибитор Chk1. Возможно, Chk1 и p53 регулируются реципрокно [36].

Основной механизм действия Chk1 на клеточный цикл - инактивация фосфатаз Cdc25 A и C.

Chk1-зависимый распад Cdc25A лежит в основе p53-независимой остановки в G1 (см. гл. 5.1.1.2) [78]. Роль Chk1 в системе G2-чекпойнта активно изучается. Имеются данные, что Chk1 не только инактивирует Cdc25С, но также активирует Wee1 [37]. Таким образом, возможно, Chk1 осуществляет "двойной удар" по комплексу циклин B-Сdk1, задерживая клетки в G2 (подробнее см. гл. 5.2.1).

4.3.2. BRCA1 и его мишени

Более чем половина случаев наследственного рака молочной железы и/или яичников связана с мутациями в гене опухолевого супрессора BRCA1 [38].

Выяснение роли BRCA1 в канцерогенезе явилось стимулом для множества исследований этого белка, и сейчас его структура и функции изучены достаточно хорошо. Оказалось, что BRCA1 является важным "передаточным пунктом" множества сигнальных путей, контролирующих повреждения ДНК.

BRCA1 входит в состав репарационных комплексов и холофермента РНК-полимеразы II, влияет на ремоделирование хроматина (remodelling). При возникновении повреждений BRCA1 активируется под дейстивем киназ ATM, ATR и Сhk2 [32, 39, 40].

Большинство эффектов BRCA1 связано со способностью влиять на транскрипцию, при этом BRCA1 не связывается непосредственно с ДНК. Основные его мишени - транскрипционные факторы, контролирующие стабильность генома, дифференцировку и пролиферацию [41].

Гиперэкспрессия BRCA1 останавливает клетки как в G1, так и в G2-фазе клеточного цикла [42]. Показано, что BRCA1 способен ингибировать Cdk2, непосредственно или через активацию p21^waf1 (см. гл. 5.1), вызывая остановку в G1.

Роль BRCA1 в G2-чекпойнте, видимо, в основном связана с активацией экспрессии белка GADD45. Поскольку BRCA1 не связывается непосредственно с ДНК, механизм трансактивации GADD45 долгое время оставался таинственным. Только в последнее время стали проясняться некоторые подробности.

Выяснилось, что взаимодействие с регуляторной областью гена GADD45 осуществляет активируемый BRCA1 белок ZBRK1. ZBRK1 - это сиквенс-специфический транскрипционный фактор, связывающийся с ДНК посредством "цинковых пальцев" [41].

Однако вопреки ожиданиям, ZBRK1 оказался вовсе не активатором, а, наоборот, репрессором GADD45, причем его репрессорная функция проявляется только в присутствии BRCA1. Таким образом, механизм регуляции транскрипции GADD45 не вписывается в рамки классической схемы. Детали этого процесса пока недостаточно изучены. Мы рассмотрим две основные гипотезы, предложенные в [41].

Одна из гипотез предполагает изменение свойств ZBRK1 в ответ на активацию BRCA1. Предполагается, что фосфорилирование BRCA1 и/или связывание его с одним из адаптерных белков уменьшает афинность взаимодействия ZBRK1 с ДНК. Не исключено также, что определенные изменения конформации ZBRK1 делают его активатором транскрипции.

Другая гипотеза основана на том (не менее неожиданном) факте, что p53 выступает в роли репрессора гена BRCA1 [44]. Как известно, p53 стабилизируется при повреждениях ДНК (при участии ATM, ATR и самого BRCA1). Повреждения вызовут накопление p53 в клетке, в результате чего BRCA1 перестанет экспрессироваться, и репрессия гена GADD45 будет снята.

Скрининг кДНК-библиотек показал, что, помимо GADD45, еще как минимум десять генов содержат 15-нуклеотидную последовательность, узнаваемую ZBRK1. Однако каким образом происходит BRCA1/ZBRK1-зависимая регуляция транскрипции этих генов (и происходит ли она вообще), пока на известно [42].

Далее...