Курсовая работа студентки 4-го курса кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ. Москва, 2001
Авторские права сохранены. Любое копирование данного текста и/или его фрагментов без разрешения автора запрещено и преследуется в соответствии с действующим законодательством РФ.

Содержание   В начало...
 
 

Активация ras в клетках млекопитающих запускает МАРК каскад, что вызывает усиление транскрипции некоторых транскрипционных факторов путем фосфорилирования их активирующего домена. Некоторые транскрипционные факторы активируются ras-зависимо, например, белки семейства ETS, такие как ELK/TCF; c-Myc, глюкокортикоидный рецептор и другие. Таким образом, векторы, содержащие гены этих транскрипционных факторов, называемых также ras-респонсивными элементами под контролем соответствующих последовательностей ДНК могут быть использованы для обнаружения активности ras (46). В данном методе используются векторы, которые несут ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (САТ) или ген люциферазы под контролем энхансера полиомовируса и могут ras - зависимо активировать транскрипцию этих генов. В клетках млекопитающих ras в цитоплазме неактивен, и сам по себе не может активировать МАРК-каскад. Это происходит благодаря тому, что ras осуществляет свой митогенный эффект, взаимодействуя с raf1, локализуя его на мембране, что необходимо для активации самого raf1 и МАРК-

каскада. Таким образом, экспрессия ras, слитого с интересующим белком- "наживкой " не ведет к активации ras- респонсивного репортерного гена. С другой стороны, перемещение "наживки" на внутреннюю сторону мембраны приводит к активации киназы raf1 и к активации МАРК-каскада, что можно обнаружить с помощью различных ras- респонсивных элементов Рис. 7. Такой локализации белка-"наживки" можно достигнуть, если он in vivo взаимодействует с белком- партнером (" мишенью"), который представлен в виде белка , слитого с сигналом мембранной локализации, например, миристоилирования. Кроме клеток млекопитающих, система была изучена также на дрожжах. Был использован температурочувствительный штамм, в котором ras-gef (фактор обмена гуаниновых нуклиотидов GDP/GTP для белка ras) был неактивен при 36 С. Введение конструкций с взаимодействующими белками обуславливала рост при пермиссивной температуре. В клетках млекопитающих взаимодействие белков вызывает транскрипцию репортерных ras- респонсивных генов, при этом регистрируется их активность (47).

9. 2. 4. Стратегия отбора взаимодействующих белков в ядре. Этот метод основан на принципах системы двойных гибридов. Он позволяет исследовать известные или предполагаемые взаимодействия белков в клетках млекопитающих (48).

В данном методе специфические взаимодействия белков в клетках млекопитающих изучают либо во временно, либо в стабильно трансфецированных линиях клеток. При этом можно использовать различные репортерные гены, включая ген, кодирующий бактериальную хлорамфеникол-ацетилтрансферазу или устойчивость к гигромицину В. Предполагают, что система может быть использована для исследования взаимодействий белков, в норме располагающихся в цитоплазме.

Стратегия отбора взаимодействующих белков в ядре основана на взаимодействии белков Х и Y в составе гибридных белков GAL4-X и VP16-Y, восстанавливающих целостность и активность химерного фактора транскрипции GAL4-VP16 и, вызывающих активацию транскрипции репортерных генов, находящихся под контролем GAL4 последовательности, взаимодействующей с фрагментом.

В системе также используют в качестве репортерного гена последовательность, кодирующую трансмембранный рецептор Т-хелперов - CD4. CD4 селективно экспрессируется на поверхности клеток, в которых происходят исследуемые белок белковые взаимодействия. Селекцию на наличие СD4-экспрессирующих клеток проводят физическими методами, такими как флуоресценто-активируемый клеточный сортинг (48).

Считается, что данная система может быть применена для поиска новых белок белковых взаимодействий путем скрининга библиотек к-ДНК. Стратегия отбора взаимодействующих белков в ядре, возможно, является одним из наиболее подходящих методов исследования белок белковых взаимодействий в случаях, когда эти взаимодействия зависят от модификаций белков, происходящих только в животных клетках.

9. 3. Бактериальная система двойных гибридов Недавно был описан бактериальный эквивалент системы двойных гибридов (49). Этот метод основан на свойствах кальмодулин-зависимой аденилат циклазы, кодируемой геном суаА Bordetella pertussis. Каталитический домен этого фермента можно протеолитически разделить на два комплементарных фрагмента, Т25 и Т 18, которые остаются ассоциированными в присутствии кальмодулина и образуют полностью активный комплекс. В отсутствии кальмодулина смесь этих фрагментов не обладает ферментативной активностью. Было показано, что при экспрессии в дефицитном по аденилатциклазе и кальмодулину штамме Е. coli, фрагменты Т25 и Т18, синтезированные в качестве гибридных белков с некими взаимодействующими белками (X и Y), могут ассоциировать между собой, что приводит к синтезу цАМФ. В Е. coli, цАМФ, связанный с активатором транскрипции CAP, является регулятором экспрессии различных генов, включая гены, вовлеченные в расщепление углеводов, таких как лактоза или мальтоза (Рис.8). Следовательно, штаммы Е. coli, не продуцирующие цАМФ, не способны расщеплять лактозу или мальтозу, но трансформанты Е. coli, содержащие гибридные взаимодействующие белки Т25-Х и T18-Y, экспрессируют цАМФ-зависимые репортерные гены и могут быть отобраны на соответствующих селективных средах (49).

Данная бактериальная система двойных гибридов способна выявлять взаимодействия между пептидами, бактериальными или эукариотическими белками, а также может быть использована для скрининга библиотек (49). Последние модификации бактериальной системы двойных гибридов также могут выявлять ДНК-белковые взаимодействия, и приспособлены для скринирования библиотек больших размеров - более чем 108 (50).

10. Заключение

Принципы системы двойных гибридов становятся все более широко используемыми по мере увеличения количества белковых комбинаций, успешно показанных в данной системе. Система двойных гибридов и ее варианты используются для обнаружения и анализа не только белок белковых, но и ДНК - и РНК-белковых взаимодействий. Применение данного подхода вышло за рамки клеток дрожжей, и взаимодействия исследуются также в клетках бактерий и млекопитающих. На основе принципов системы двойных гибридов был разработан метод анализа комплексных белковых систем - метод трех гибридов и недавно с помощью метода на основе двойных гибридов было обнаружено взаимодействие четырех белков (51).

Далее...