Курсовая работа студентки 4-го курса кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ. Москва, 2001
Авторские права сохранены. Любое копирование данного текста и/или его фрагментов без разрешения автора запрещено и преследуется в соответствии с действующим законодательством РФ.

Содержание   В начало...
 
 

Вторичная структура мРНК перед инициаторным кодоном и после него может оказывать как положительное влияние на эффективность инициации трансляции, так и отрицательное, что зависит от свободной энергии(DG) данной вторичной структуры и ее расположения.

Наличие вышележащей вторичной структуры. "Шпилька", находящаяся непосредственно на 5'-конце мРНК, в большей степени ингибирует инициацию трансляции, чем расположенная между 5'-концом и AUG (инициаторным кодоном) (Kozak, 1986b, 1989b, 1991а).

"Шпилька" с DG = -30 ккал/моль, расположенная в 52 и более нуклеотидах от 5' - конца мРНК (Kozak, 1986b, 1991а), не оказывает ингибирующего эффекта на инициацию трансляции. То есть 40S рибосомальная субъединица в комплексе с инициаторными факторами, присоединившись к 5' - кэпу и мигрируя по мРНК, может расплести такую "шпильку за счет хеликазной активности инициаторных факторов. Расположенная в 12 нуклеотидах вторичная структура, с DG = -30ккал/моль, снижает трансляцию на 75%, так как 40S субъединица не может эффективно связаться с 5' - концом из-за слишком близкого расположения "шпильки" (Kozak, 1989b, 1991а). Также было показано, что вторичная структура, включающая в себя AUG и имеющая энергию DG = -30 ккал/моль, практически не вызывала изменения уровня трансляции (в одних экспериментах наблюдалось снижение на 20%, в других уровень трансляции оставался прежним) (Kozak, 1986b). Также было продемонстрировано, что в гипертонических условиях (достигались повышением концентрации сахарозы) такая вторичная структура стабилизировалась и ингибировала трансляцию (эффективность трансляции составляла ~1/10 контроля трансляции в нормальных условиях) (Kozak, 1986b).

"Шпилька" с DG = -50 ккал/моль, находящаяся в 5'-концевой области, полностью ингибирует трансляцию (Kozak, 1986b, 1989b, 1991а). Если такая вторичная структура находится перед AUG, то 40S рибосомальная субъединица мигрирует с 5'-конца мРНК до "шпильки", а перед ней останавливается, оказываясь "пойманной", так как 43S инициаторный комплекс не может "расплести" ее. Но 80S рибосома (с в комплексе с факторами элонгации) способна расплавить такую (с DG = -50-60 ккал/моль) вторичную структуру, какая-то часть элонгирующих рибосом ее преодолевает, хотя эффективность синтеза ниже, чем в отсутствие вторичной структуры (Kozak, 1989b, 1991а).

Наличие нижележащей вторичной структуры. Вторичная структура, лежащая после инициаторного кодона, в большинстве случаев повышает эффективность инициации с этого кодона. "Шпилька" с DG = -19 ккал/моль, если она расположена после AUG, увеличивает эффективность инициации трансляции с этого AUG, чему может быть несколько объяснений:

- 48S преинициаторный комплекс (43S комплекс с eIF4F и eIF4В) задерживается из-за наличия "шпильки", так как необходимо время для ее расплавления, вследствие этого увеличивается время для узнавания инициаторного кодона;

- если между "шпилькой" и инициаторным кодоном 14 нуклеотидов, то 40S субъединица останавливается непосредственно напротив стартового кодона узнающим сайтом, вследствие чего увеличивается вероятность узнавания (Kozak, 1990, 1991а).

AUG в субоптимальном (не самом благоприятном) контексте узнается с большей эффективностью, если нижележащая последовательность способна образовать вторичную структуру, в этом случае узнавание AUG рибосомами млекопитающих становится менее зависимо от контекста (Kozak, 1990). Такое влияние нижележащей вторичной структуры объясняет, почему для большинства мРНК позвоночных, несмотря на отсутствие полной консенсусной последовательности (GCCA/GCCAUGG), инициаторным является первый AUG кодон, а также каким образом AUG в слабом контексте может быть практически на 100% функциональным (если вторичная структура на оптимальном расстоянии от AUG) (Kozak, 1990).

Благодаря присутствию нижележащей вторичной структуры возможно более эффективное распознавание не-AUG кодонов в качестве инициаторных (Kozak, 1990). Экспериментально (с использованием генетических конструкций) было показано, что для усиления узнавания GUG и UUG достаточно наличия благоприятного контекста и нижележащей вторичной структуры на оптимальном расстоянии от инициаторного кодона (~12 нуклеотидов), но только для небольшого числа мРНК позвоночных показана инициация на не-AUG, хотя нижележащая вторичная структура характерна для многих - GC-богатые последовательности позволяют формировать многочисленные двуцепочечные участки (вторичную структуру) (Kozak, 1990).

3.1.4. 5'-нетранслируемая область (лидерная последовательность). Одним их подтверждений сканирующей модели является зависимость инициации трансляции от длины и структурированности лидерной последовательности. 5'-нетранслируемая область (5' - НТО) может содержать от 3 до 700 и более нуклеотидов. Для большинства эукариотических мРНК - 40-80 нуклеотидов, крайние варианты характерны для вирусных мРНК (Kozak, 1983а).

Если длина лидерной последовательности (от кэпа до AUG кодона) менее 12 нуклеотидов, то для клеточных мРНК значительно уменьшается вероятность узнавания 40S рибосомальной субъединицей инициаторного кодона, она может "проскакивать" AUG кодон при сканировании. При удлинении лидера до 20 нуклеотидов или введении нижележащей "шпильки" эффективность узнавания и инициации повышается. Было показано, что дальнейшее удлинение лидера (в диапазоне от 20 до 80 нуклеотидов, из-за малого содержания G не образующего вторичной структуры) вело к пропорциональному увеличению эффективности трансляции in vitro (Kozak, 1991а).

3.1.5. 3' -нетранслируемая область. Подавляющее большинство мРНК, биосинтез которых происходит в ядре, имеет 3'-концевую поли(А) последовательность, содержащую от 10 до 250 нуклеотидов. Она добавляется к пре-мРНК поли(А)-полимеразой (при участии еще нескольких факторов) в результате процессинга, который вовлекает сайт-специфическое расщепление с последующим полиаденилированием, т.е. эта последовательность не закодирована в генах. Сайт расщепления определяется высоко консервативной последовательностью AAUAAA, расположенной в 5-30 нуклеотидах до него, и другими, менее консервативными последовательностями после этого сайта (Jacobson, 1996).

Было показано в экспериментах in vitro, что при увеличении длины поли(А) "хвоста" с 5 до 32 нуклеотидов наблюдалось повышение эффективности трансляции - максимальное количество рибосом в составе полисом. Также было продемонстрировано in vitro (в экстракте ретикулоцитов), что эффективность трансляции мРНК, не имеющих поли(А) "хвоста" (поли(А)- мРНК), составляет лишь 1/3-1/2 от таковой для поли(А)+ мРНК. Поли(А) влияет на эффективность трансляции эукариотических мРНК in vivo (Jacobson, 1996).

Цитоплазматический поли(А) - связывающий белок - РАВР (poly(A)-binding protein)- является посредником, через которого поли(А) влияет на трансляцию. РАВР присоединяется к поли(А)-последовательности с образованием мультимеров, причем чем длиннее поли(А) "хвост", тем больше с ним связывается субъединиц РАВР, что коррелирует с повышением уровня трансляции. За мультимеризацию РАВР отвечает его С-концевой домен (Le et al., 1997).

Существует модель (closed-loop model), объясняющая механизм действия РАВР: белки, связанные с кэпом, взаимодействуют с РАВР, который присоединен к поли(А) "хвосту", в результате чего мРНК образует петлю, что стимулирует присоединение 60S рибосомальной субъединицы к 48S преинициаторному комплексу; это увеличивает эффективность трансляции (Jacobson, 1996).

Таким образом кэп и поли(А) взаимодействуют через связанные с ними белки, это и приводит к повышению уровня трансляции. Для растений было показано, что первичный контакт между РАВР и eIFiso4F (форма eIF4F, которая функционирует в клетках растений) осуществляется через N-концевой домен eIFiso4G (он также содержит участки связывания с eIFiso4Е и eIFiso4А). Это взаимодействие может вызвать конформационные изменения РАВР или его мультимеризацию, что понижает его способность диссоциировать из комплекса с поли(А) "хвостом", таким образом повышая сродство РАВР к РНК, к ее поли(А)-последовательности (Le et al., 1997). В клетках млекопитающих РАВР взаимодействует с eIF4F и с eIF4А через вспомогательный белок - PAIP-1 (РАВР-interacting protein)(Gallie, 1998).

Есть несколько возможных объяснений того, какова цель взаимодействия РАВР с инициаторными факторами эукариот:

- повышение стабильности связывания с мРНК инициаторных факторов и РАВР и, как следствие, повышение эффективности трансляции;

- отбор для трансляции только интактных мРНК, имеющих кэп и поли(А) "хвост";

- физическое сближение 3'-конца и 5'-конца мРНК способствует повторной инициации с данной мРНК;

- поддержание необходимого количества каких-либо мРНК в клетке: например, при дезаденилировании происходит отщепление кэпа, а присутствие РАВР, связанного с поли(А) "хвостом", предотвращает этот процесс (Le et al., 1997).

Далее...