В .С. Малышев, А .Г. Тоневицкий, А .М. Ведяков, О .Е. Потехин, Н .А. Арефьева, Ю .В. Сергеев, В.Г. Лунин.

Центральная клиническая больница Медицинского центра УД Президента РФ, Институт трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, Институт аллергологии и клинической иммунологии, Москва.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус гепатита С, РНК, доноры крови, ПЦР.

Вирус гепатита С (ВГС) является причиной большинства случаев гепатитов "ни А, ни В" с парентеральным механизмом передачи. ВГС относится к семейству флавивирусов с одноцепочечным РНК-геномом. ВГС-инфекция представляет серьезную проблему для здравоохранения из-за высокой частоты развития хронического гепатита С (хронизация у 75-80 %), с риском развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [ 3 ].

Заражение ВГС индуцирует выработку антител к ВГС (анти-ВГС), которые, ввиду высокой хронизации инфекции, рассматриваются в качестве маркера инфицирования. Уровень анти-ВГС позитивных лиц колеблется от 0,2 - 0,6 % в Северной Европе до 4 - 20 % в Африке. В России анти-ВГС выявляется у 1 - 3 % населения, с более высокими показателями в Сибири и на Дальнем Востоке. При этом наблюдается дальнейший рост числа инфицированных [1]. При скрининге донорской крови определяют антитела к вирусу гепатита С. Однако данный подход не в полной мере предотвращает случаи посттрансфузионных гепатитов [6]. В связи с этим в некоторых странах Западной Европы с 1999г. введено обязательное тестирование донорской крови на РНК ВГС, основанное на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и широко применяемое в диагностике и мониторинге ВГС-инфекции [ 2].

Цель работы

Оценка актуальности тестирования доноров крови на РНК ВГС с помощью различных ПЦР-методик: двустадийной (nested) и теста Amplicor hepatitis C virus test (Roche).

Материалы и методы. В работе рассмотрены результаты исследования, выполненного в Центральной клинической больнице МЦ УД Президента РФ и в НИИТиИО МЗ РФ. Было обследовано 20 доноров отделения "Банк крови" с положительными/сомнительными данными при тестировании на анти-ВГС. Данные по биохимическим показателям (активность трансаминаз АЛТ и АСТ) и маркеры вирусного гепатита В (антитела к HBs и к HBc) получены при рутинном обследовании доноров. Подробная характеристика доноров представлена в таблице 1.

Определение антител против вируса гепатита С. Скрининг сыворотки крови доноров проводили при каждой кроводаче с помощью иммуноферментной тест-системы UBI HCV EIA 4.0 (United Biomedical Inc. USA). Данная тест-система содержит сорбированные синетические пептиды, соответствующие основным антигенным участкам белков ВГС: Сor, NS3, NS4 и NS5, что позволяет выявлять антитела класса IgG соответствующей специфичности в сыворотке крови. Анализ спектра специфичности антител к белкам ВГС проводили в тесте иммуноблотта с помощью тест-системы LiaТek HCV III (Organon Тeknika), позволяющей раздельно учитывать следующие специфичности антител: Сor ( 2 специфичности), Е2/NS1, NS3, NS4 и NS5. Данные до 1996 г. получены при использовании более ранней версии тест-системы LiaТek, включавшей аналогичные пептиды, за исключением Е2/NS1 и NS5.

Детекция РНК ВГС с помощью тест-системы Аmplicor hepatitis C virus test. Детекцию РНК вируса гепатита С проводили согласно инструкции, прилагаемой фирмой. Амплификацию осуществляли на амплификаторе Perkin Elmer 2400.

Детекция РНК ВГС методом двустадийной (nested) ПЦР с использованием фермента Tth-ДНК -полимеразы. Для выделения РНК использована модифицированная методика, описанная ранее[5]. РНК выделяли из 200 мкл плазмы. Полученную РНК растворяли в 15 мкл буфера для элюции РНК. Для синтеза кДНК и 1 раунда ПЦР 10 мкл полученной РНК. Реакцию обратной транскрипции (RT) и 1-й раунд ПЦР проводили в объеме 25 мкл в одной пробирке с использованием фермента Tth-полимеразы с высокой степенью RT-активности (ВНИИ СБ РАСХН , Россия). Реакционная смесь для 1-раунда ПЦР состояла из 1Х Tth one tube RT-PCR буфера, 2,5 Ед Tth-днк- полимеразы 0,2 мM каждого из 4, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дАТФ, д ЦТФ, дТТФ, дГТФ), 10 мкл РНК и по 10 пмоль внешних праймеров [8 ]:

5'-3' - ctg tga gga act act gtc tt- прямой

5'-3' - tat cag gca gta cca caa gg-обратный

Для 2 раунда ПЦР брали 0,5 мкл продукта 1 раунда амплификации. 2-й раунд ПЦР проводили с помощью Taq ДНК-полимеразы в объеме 25 мкл. ПЦР проводили в объеме 25 мкл. Стандартная реакционная смесь включала: 67 мМ Трис-НCl (рН 8,4),16 мМ сульфата аммония, 2,5 mM MgCl2 0,125 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 8% глицерин, 0,001% ксиленцианол, 2,5 Ед Taq-ДНК-полимеразы (ВНИИ СБ РАСХН, Россия), 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и по 8 пкмоль внутренних праймеров [8]:

5'-3' - ttc acg cag aaa gcg tct ag - прямой

5'-3' -acc caa cac tac tcg gct ag - обратный

RT-ПЦР проводили на многоканальном амплификаторе "Терцик" МС-2 (ДНК-технология, Россия) по следующей программе:

RT + 1 раунд ПЦР:

75 0С - 5 мин., 560С - 35 мин., 940 С - 2 мин.,

затем

94 0 С - 10 сек |

56 0 С - 10 сек | 40 циклов

72 0 С - 10 сек |

2 раунд ПЦР:

94,50 С - 2 мин

95 0 С - 10 сек |

55 0 С - 10 сек | 28 циклов

72 0 С - 10 сек|

Детекцию продуктов реакции проводили методом электрофореза в 2% агарозе c 0,001% этидиум бромида, с последующей визуализацией в ультрафиолете на трансиллюминаторе. Для исключения ложноположительных результатов вследствие контаминации детекцию продуктов ПЦР и работу с продуктами 1 раунда проводили в отдельных комнатах, 30% исследуемых образцов составляли негативные контроли.

Результаты и обсуждение

При тестировании системой "Amplicor HCV-test" РНК HCV была обнаружена у 5 из 20 исследованных доноров крови ( 25 %). С помощью разработанной двустадийной (nested) ПЦР РНК HCV была выявлена в сыворотках крови тех же доноров, что и предыдущей методикой (Таблица 1). При этом оба вида ПЦР анализа проводили в начале 2000 года практически одновременно (но в разных лабораториях) с идентичными образцами замороженной сыворотки крови.

При сравнении полученных данных с результата- ми ПЦР-анализа, проведенного ранее (главным образом в середине 1999 года) для данной группы доноров в различных лабораториях, отмечается значительно большая частота выявления РНК ВГС - у 14 человек (70 %).

Отмечено, что РНК ВГС обнаруживали в ряде случаев при сомнительных данных о наличии антиВГС (доноры 1, 6, 9, 11 ) и даже при их отсутствии в скрининговом тесте (донор 13). При этом в последнем случае позитивный результат на РНК был ассоциирован с минимальным уровнем анти-NS4 антител, определяемых только в иммуноблотте.

Повышение активности трансаминаз в сыворотке крови во время отвода донора было только у 3 доноров (12%). Не обнаружено изменения в частоте исследованных маркеров вирусного гепатита В в анализируемой группе доноров относительно остальных доноров.

С момента открытия ВГС в 1989г. выявление антител стало основным методом диагностики этой инфекции. При этом повышение надежности тест-систем шло путем расширения спектра используемых синтетических или рекомбинантных полипептидов [4]. Используемые в настоящее время тест-системы третьего поколения включают, наряду с антигенами нуклеокапсида (Сor-пептиды ), основные неструктурные белки: NS3, NS4, NS5. Однако даже в таких тест-системах выявление анти-ВГС становится возможным только спустя 12 - 20 недель после заражения [7]. Таким образом, на протяжении серонегативного периода, а также в случае угнетенного антителообразования, единственным методом профилактики посттрансфузионного заражения ВГС является выявление РНК ВГС [6] .

Выбор представленной группы доноров для повторного ПЦР-анализа на РНК ВГС в значительной степени был связан с задачей уточнения уровня вирусоносительства среди анти-ВГС позитивных или сомнительных доноров. Полученные с использованием наборов Аmplicor test и двустадийного собственного ПЦР-набора данные подтвердили наличие РНК ВГС только у 4 из 14 ранее РНК-позитивных доноров ( 28,6% ) и позволили обнаружить РНК у 1 из 6 ранее РНК-негативных доноров (16,7%). Учитывая высокую чувствительность и специфичность результатов, получаемых в Аmplicor hepatitis C virus test, а так же их идентичность с данными собственного ПЦР-анализа (nested-ПЦР), следует признать значительный уровень ложноположительных результатов данных ПЦР-анализа, полученных ранее при исследовании данной группы доноров в других лабораториях. Отсутствие ложноположительных результатов при использовании высокочувствительной методики nested-ПЦР можно объяснить строгим разделением отдельных стадий анализа, а также применением фермента Tth-ДНК-полимеразы с высокой степенью обратнотранскриптазной активностью. Данное свойство фермента позволяет объединять этапы RT и 1-й раунд амплификации в одной пробирке и уменьшить объем манипуляций.

Выявление РНК ВГС у одного из ранее РНК-негативных доноров свидетельствует о недостаточной чувствительности одностадийного ПЦР. Этот пример также указывает на возможность вирусоносительства при минимальном уровне антител у доноров.

Выводы:

1. Представленный двустадийный метод ПЦР анализа на РНК ВГС сопоставим по чувствительности и специфичности с методом Аmplicor hepatitis C virus test (Roche).

2. На фоне отрицательных результатов в ИФА тестах на наличие антител к ВГС в крови доноров возможно достоверное обнаружение РНК ВГС с помощью ПЦР.

3. Использование метода ПЦР в массовом скрининге донорской крови на наличие РНК ВГС может сопровождаться появлением как ложнонегативных, так и ложноположительных результатов, что требует дополнительных исследований с помощью сертифицированных тест-систем.

ЛИТЕРАТУРА.

1 . Г.С. Коршунова / В Сб.: "Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики"- М .:1999.-С.111-112.

2. Н. А. Федоров, В. П. Чуланов, Е. В. Волчкова и др. // Российский журнал гастроэнтрологии, гепато- логии, колопроктологии.- 1995.- N 4. - том 3 - С. 12-15.

3. Ш. Шерлок, Дж. Дули. Заболевания печени и желчных путей. - М.: Гэотар Медицина, 1999 - 859 С.

4. Alter HJ. // Hepatology - 1992 - 15 - р.350-353.

5. P. Chomczynski, N. Sacchi //Analyt. Biochem.- 1987.- Vol.162., - P.156-159.

6. Farci P, London WT, Wong DC at al. // J Infect Dis. - 1992 - 165 - р.1006-1011.

7. Huber KR, Sebesta C, Bauer K. // Hepatology, 1996 - 24 - р.471-473.

8. Okamoto H., SugiyamaY., Okada S. et al. // J. Gen. Virol.. - 1992.- Vol. 73 - P. 673-679.

Таблица 1 Характеристика группы доноров крови, отведенных от кроводач по показателям риска инфицирования ВГС
N	Донор	Г/р/Пол	Профессия	Стаж донорства	Причина и дата отвода	Анти-ВГС повторно	Иммуноблотт LiaTek/LiaTekIII(месяц,год)	РНК ВГС Исходно	РНК ВГС Тесты*: Amplicor/НИИТи ИО	Биохимия**(год)	Маркеры: АтНВs АтНВс
1	Абр.	60 Ж	Гос.служ.	С 1995г.	Ат-ВГС 03.95	Сомн. 08.98	10.98 следы Соr1	+ 06.99	- / -	Н	Полож Полож
2	Алб.	61 Ж	Гос.служ.	С 1995г.	Ат-ВГС 08.98	Сомн. 10.98	10.98 следы NS5	- 06.99	- / -	Н	Отр Отр
3	Ащ.	58 М	Строитель	Перв.	Ат-ВГС 01.99	+ 03.00	03.00 Cor2+,NS3+ NS4++	- 07.99	- / -	Н	Отр Отр
4	Бир.	53 Ж	Мед/с	С 1972г.	Ат-ВГС 01.95	+ 02.00	02.00 Cor1,2,NS3,4,5+++	+ 07.97	- / -	В 96^х10	Отр Отр
5	Бат.	68 Ж	Врач	С 1994г.	Ат-ВГС 06.98	+ 02.00	11.98 NS4+/- 02.00 NS4,5+	- 07.98	- / -	Н	Отр Отр