А. А.Дьяченко, А. Г.Дьяченко

118 КДП СибВО, Новосибирск, Россия

Сумский госуниверситет, Украина

Изучался цитокиновый профиль у 84 больных острым и хроническим гепатитом С (ОГ и ХГ), циррозом печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК). Обнаружено значительное повышение уровня основных иммунорегуляторных молекул IFN-gamma и IL-2 у всех ВГС инфицированных пациентов, причем максимальные значения наблюдались при ОГ. У хронически инфицированных пациентов концентрация этих цитокинов положительно коррелировала со стадией заболевания. У всех ВГС инфицированных наблюдалось существенное повышение уровня провоспалительных цитокинов TNF-alpha и IL-l-beta также в зависимости от поражения печени. Концентрация IL-6 была повышена у всех инфицированных, а IL-8 - только в начальных стадиях заболевания. Уровень противовоспалительного цитокина IL-4 был заметно ниже нормы при ХГ, а концентрация IL-10 менялась мало.

Ключевые слова: вирус гепатита С, хронический гепатит, цитокины.

Вирус гепатита С (ВГС) является главной причиной парентеральных ни-А, ни-В гепатитов [5]. Его распространенность в общей популяции колеблется от 0,15% (Скандинавия) до 44% (Египет, Камерун) [5]. Острая ВГС инфекция протекает, как правило, бессимптомно. Лишь у 10-15% больных острым гепатитом (ОГ) обнаруживаются минорные клинико-лабораторные манифестации процесса. Однако у 80% и более больных ОГС инфекция становится персистентной. Хронический гепатит С (ХГС) является ведущим фактором риска развития цирроза печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК).

Примерно у 20% инфицированных ВГС процесс прогрессирует до фиброза и цирроза [22,23]. От 20 до 90% последних в течение 5 лет умирает от ГЦК [18,19,22,26]. Математическое моделирование, проведенное с учетом быстро увеличивающейся группы риска (инъекционные наркоманы), предсказывает 4-кратный рост смертности от связанной с ВГС печеночной декомпенсацией и ГЦК [22]. Поэтому столь важным представляется найти ответы на следующие вопросы: каковы особенности антивирусного иммунного ответа в первые недели острой ВГС инфекции у индивидуумов с самоизлечивающимся заболеванием? В чем заключается успешная противовирусная иммунная стратегия организма? Наконец, каковы причины персистирующей инфекции? В настоящее время твердо установлено, что ВГС инфекция индуцирует сильные гуморальный и клеточный иммунные ответы 151. Белки кора NS3 и NS4 являются наиболее иммуногенными антигенами как для В-клеток, так и для HLA-II-рестрицированных CD4+ Т-клеток. Инфильтрирующие печень CD8 + цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) распознают эпитопы в пределах кора. El, E2/NS1 и NS2 белков посредством HLA-I антигенов. Ответы ЦТЛ на коровый и другие белки регистрируются в периферической крови больных хроническим гепатитом (ХГ). Хотя ответы ВГС-специфических эффекторных В- и Т-клеток могут привести к элиминации вируса, в большинстве случаев они не способны воспрепятствовать переходу ВГС инфекции в хроническую форму. До сих пор не обнаружены протективные В- и Т-клеточные эпитопы. Совершенно очевидно, что неадекватный иммунный ответ играет фундаментальную роль в незавершенности острой инфекции, превращению ее в персистирующую и, очевидно, в патогенезе повреждения печени при ХГ.

Определяющую роль в иммунном ответе играют цитокины. Они принимают участие в развитии воспалительного процесса и играют важную роль в повреждении печени, активируя цитотоксические эффекторные механизмы. По данным ряда авторов, ВГС инфекция приводит к стимуляции продукции цитокинов Тh1 типа-интерферона-gamma и IL-2 [20.25]. Повышенные уровни провоспалительных цитокинов IL-1beta и TNF-alpha установлены при хроническом гепатите С [17]. Согласно другим данным, ВГС и ВГВ инфекции повышают сывороточную концентрации IL-4 и IL-6, одновременно снижая уровень интерлейки на 2 [З].

Целью настоящей работы было исследование изменений экспрессии основных иммунорегуляторных молекул при разных формах ВГС инфекции от острой до хронической, включая ее осложнения: цирроз печени (ЦП) и гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК).

Материалы и методы. Всего под наблюдением состояло 84 серопозитивных пациента, из них 61 мужчина и 23 женщины. В группе мужчин 21 человек были призывного возраста. У них наблюдался только острый или хронический гепатит С без осложнений. Средний срок наблюдения составлял 3,9 1,0 год (от 1,2 до 4,5 лет). Острая ВГС инфекция была установлена у 10 больных и подтверждена сероконверсией, повышением уровня сывороточной аланинаминотрансферазы (АЛТ) и появлением в крови ВГС РНК. За время наблюдения у 4 из них концентрация АЛТ снизилась до нормы, а вирусная РНК из крови исчезла. У остальных уровень АЛТ оставался персистентно повышенным, а ВГС РНК обнаруживалась в крови вплоть до прекращения наблюдения.

У 36 пациентов в соответствии с существующей классификацией был установлен хронический ГС. Все пациенты были позитивны на антиВГС антитела. Вирусная РНК была обнаружена у 23 больных. Вирусная нагрузка была определена у 18 пациентов и составляла от 2*104 до 8*106 ВГС геномов на 1 мл сыворотки. 15 больных были обследованы на содержание минуснити ВГС РНК, и у 6 из них были обнаружены репликативные интермедиаты. Уровень АЛТ был повышен у 15 пациентов этой группы.

Группы больных с циррозом печени и гепатоцеллюлярной карциномой включали 22 и 16 человек соответственно. Диагноз ЦП во всех случаях верифицирован гистологически. Все обследованные были ВГС-серопозитивны.

В качестве контроля использовали кровь 25 здоровых мужчин-доноров призывного возраста.

Поскольку положительный результат антиВГС ИФА считается недостаточным для установления факта инфекции [20], мы использовали следующие критерии истинной ВГС инфекции: позитивный результат ИФА с набором второго поколения (Abbott Laboratories) и фактором превышения не менее 3,0, наличие в сыворотке РНК ВГС, повышенный уровень АЛТ (выше 40 ед/л). Помимо этого определяли наличие антител к вирусам ГА (анти-HAV-IgM) и ГВ (анти-HBc-IgM, анти-HBs).

Важнейшим маркером ВГС инфекции является обнаружение вирусной РНК. Современные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяют выявить РНК ВГС в крови 100% больных ХГ независимо от стадии патологического процесса [14]. Мы наличие или отсутствие вирусных частиц в крови пациентов определяли при помощи обратно-транскриптазного варианта полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), используя набор Ампликор (Hofmann-La Roche). ВГС РНК выделяли из 100 мкл сыворотки при помощи лизирующего буфера, содержащего гуанидинизотиоцианат. После инкубации при 60? С в течение 10 мин добавляли равный объем изопропанола и РНК осаждали центрифугированием. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в бициновом буфере, содержащем марганец. Дальнейшая процедура соответствовала инструкции изготовителя набора. Чувствительность теста составляла 100-200 вирусных геномов/мл. Для количественного определения вирусной нагрузки использовали конкурентный вариант ОТ-ПЦР с теми же праймерами к 5'-нетранслируемой области генома. Праймеры к той же генной области были использованы и для детекции минуснити ВГС РНК.

Концентрацию цитокинов в крови определяли при помощи коммерческих иммуноферментных наборов на IFN-gamma, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-alpha.

Результаты

Известно, что острый гепатит С протекает в основном без выраженных симптомов интоксикации. У 7 из 10 наблюдавшихся нами больных с острой ВГС инфекцией была квалифицирована легкая форма, у остальных - среднетяжелая. Иктеричность была умеренно выраженной при уровне билирубина от 27,5 до 215 мкмоль/л. Нормализация уровня билирубина происходила в сроки от 2 до 6 недель. В отличие от билирубина активность АЛТ не зависела от степени тяжести и в среднем составляла 967,4 108,2 ед/л. У всех больных этой группы имелись основные маркеры ВГС инфекции: антитела к вирусным белкам и вирусная РНК.

В группе хронических больных только у 41,6% уровень АЛТ был умеренно повышен (от 63,5 до 181,7 ед./л). Средняя активность АЛТ в сыворотке пациентов с ХГ составляла 52,7 21,7 ед/л. У значительной части этих больных наблюдалась активная фаза инфекции, поскольку у 23 из них была выявлена вирусная РНК (средний уровень нагрузки составлял около 2,1*106 копий/мл), а у 6 - репликативная форма генома. В то же время примерно у половины больных клинические симптомы болезни отсутствовали.

Все больные с повреждением печени (цирроз и ГЦК) содержали в крови анти-ВГС антитела и были серонегативны в отношении вирусов гепатита А и В. У 19 из 22 больных ЦП повреждение печени носило умеренно выраженный характер (группа В по классификации Чайлд-Турко): содержание билирубина от 48,7 до 86,3 мкмоль/л, концентрация альбумина от 31,2 до 33,8 г/л, средний уровень АЛТ 59,1 28,4 ед/л. У 3 пациентов с выраженным фиброзом концентрация альбумина была ниже 30 г/л, уровень билирубина колебался от 75,4 до 152,6 мкмоль/л при нормальной активности трансаминаз. У больных ГЦК наблюдалась II-III стадия процесса при среднем уровне билирубина124,7 4б,2 мкмоль/л и концентрацией альбумина в пределах 30 г/л. В сыворотке крови 17 из 38 больных ЦП и ГЦК была выявлена ВГС РНК.

У всех больных с маркерами ВГС инфекции в периферической крови наблюдался умеренный лейкоцитоз при увеличении относительного и абсолютного содержания лимфоцитов, прежде всего несущих маркер CD3 (Т-лимфоциты). Однако эти изменения был за пределами достоверности (р>0,1).

При исследовании цитокинового профиля больных с маркерами ВГС инфекции обнаружены существенные и разнонаправленные изменения содержания многих лимфокинов в сыворотке крови (табл.1). Обнаружено значительное повышение концентрации цитокинов Т-хелперных лимфоцитов 1 типа (Th1): IFN-gamma и IL-2, причем максимальный уровень этих цитокинов, в несколько раз превышающий контрольные значения, отмечен при ОГ. В сыворотке других групп больных концентрация IFN-gamma и IL-2 снижается, тем не менее достоверно превышая контрольные значения (р<0,01).. У больных с серьезным поражением функции печени (ЦП и ГЦК) концентрация IFN-gamma и IL-2 была достоверно повышена не только по сравнению с нормой, но и с ХГ.

Анализ статуса провоспалительных цитокинов (TNF-alpha, IL-lbeta, IL-6, IL-8) показал значительный рост секреции всех иммуномедиаторов этой группы. Продукция цитокинов TNF-alpha и IL-lbeta при ОГ и ХГ была достоверно выше по сравнению с контролем, а при ЦП и ГЦК наблюдался дальнейший рост их концентрации. Наблюдавшийся рост концентрации IL-6 не зависел от формы заболевания, а повышение уровня IL-8 отмечено только при ОГ и ХГ. При ЦП и ГЦК концентрация этого цитокина не отличалась от нормы. Отмечается связь этого показателя со степенью активности инфекции: у хронических больных в активной фазе концентрация IL-8 превышала контрольные значения (р<0,05), в то время как при персистентной инфекции достоверной разницы с контролем не выявлено (66,5 18,7 и 22,7 11,3 пкг/мл соответственно).

Обращает на себя внимание, что у всех больных не изменено (IL-10) или подавлено (IL-4) накопление противовоспалительных цитокинов.

Далее...

Таблица 1. Концентрация цитокинов в сыворотке крови ВГС инфицированных пациентов (пкг/мл)
	Норма	ОГ	ХГ	ЦП	ГЦК
Тh1-цитокины
INFgamma	35,7 7,2	278,4 69,1*	65,3 13,4*	101,9 15,7*	99,1 18,7*
IL-2	26,9 8,8	184,6 25,7*	61,8 12,4*	107,4 16,6**	117,3 21,1**
Провоспалительные цитокины
TNFalpha	12,5 6,1	50,5 14,5*	64,2 19,1*	129,4 32,9**	117,8 27,5**
IL-1beta	41,7 16,4	78,4 21,2*	90,1 18,6*	168,7 25,6**	151,3 17,4**
IL-6	14,8 9,3	85,44:17,1*	66,9 11,5*	97,2 22,7*	84,1 19,7*
IL-8	17,5 3,9	135,1 36,4*	48,6 12,5*	15,1 9,6	13,9 5,8
Противовоспалительные цитокины
IL-4	42,1 8,2	35,6 17,4	16,4 8,1*	11,5 7,3*	19,2 6,4*
IL-10	13,1 7,4	20,4 6,6*	18,5 5,7	12,3 4,5	16,7 9,3
Примечание:* - достоверные различия по сравнению с нормой, ** - достоверные различия по сравнению с ХГ.