А. А. Кишкун, С. Л. Арсенин

Медицинский центр Банка России, Москва

Ключевые слова: Helicobacter pylori, Western-blot, полимеразная цепная реакция, серотип, генотип, болезни желудка, двенадцатиперстной кишки.

Механизм повреждения слизистой оболочки желудка (СОЖ) и двенадцатиперстной кишки при инфекции Helicobacter pylori (HP) изучен в последние годы достаточно подробно. На клиническом и экспериментальном материале доказано, что HP стимулирует апоптозы, тем самым усиливая гибель клеток в краях язв, что и затрудняет их заживление. Наиболее выраженной апоптозной активностью обладают CagА+ (cytotoxin-associated gene А) штаммы HP [18]. Поэтому получение данных о свойствах штаммов HP (продуцируют ли они CagА и VacA - vacuolating cytotoxin А) у пациентов имеет важное практическое значение для обоснования адекватного лечения.

В своих исследованиях М. Plebani и соавт. [16], В.Д. Пачесников и соавт. [6] показали, что инфицирование CagА-позитивными (серотип 1) штаммами HP является фактором риска развития выраженного воспалительного ответа в СОЖ. Л.И. Аруин [1], J. Rudi и соавт. [19] приводят данные о том, что пациенты с CagА+ штаммами HP в значительно большей степени подвержены риску развития язвенной болезни и рака желудка, чем инфицированные CagА-штаммами.

В настоящее время получить данные о генотипе штаммов HP возможно методом ПЦР, a о серотипе - серологическими методами - Western-blot и определением антител к CagА белку HP.

Western-blot - встречная преципитация в геле антител сыворотки крови больного с различными белками HP, меченными зондами, подвергнутыми разделению по молекулярной массе с помощью электрофореза и нанесенными на нитроцеллюлозу.

Метод Western-blot позволяет визуализировать полный серологический профиль HP, обнаружить и дифференцировать более вирулентный тип I HP от типа II, а добавление собственного рекомбинантного протеина HP (антигена) отличать текущую инфекцию (Current infection marker -маркер текущей инфекции) от ранее перенесенной.

Следует отметить, что серотип HP не всегда может совпадать с обнаруживаемым у больных генотипом штаммов HP. Это в первую очередь обусловлено типом иммунного ответа на присутствие и повреждающее действие бактерий [5]. В связи с чем, для более правильного представления о штаммах HP у каждого отдельного пациента наряду с исследованием серотипа необходимо определять генотип бактерий. По данным P.S. Ganga-Zandzou и соавт [12], при двухлетнем наблюдении основные показатели хеликобакберного гастрита прогрессировали главным образом у носителей CagА+ штаммов HP. H.I. Maaroos и соавт [14] при длительном наблюдении (18 лет) взрослых, инфицированных HP, установили, что атрофический гастрит развивается гораздо чаще у носителей CagА+ штаммов HP, по сравнению с лицами инфицированными CagА-штаммами HP.

Поэтому целью данного исследования было изучение роли различных методов диагностики в установлении генотипа HP у больных с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки.

Материалы и методы. В основу работы положены результаты обследования 89 больных хроническим гастритом (ХГ), язвенной болезнью желудка (ЯБЖ) и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) в фазе обострения, а также группы больных (21 человек) без гастродуоденальной патологии. Из 89 больных 63 пациента страдали ЯБДК, 11 человек ЯБЖ с локализацией процесса в пилорической зоне и 15 пациентов с ХГ. У всех обследованных больных диагноз был установлен на основании клинико-анамнестических сведений, данных эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) и верифицирован морфологически. Всем больным обследование проводилось по единому плану. Во время ЭГДС проводилась визуальная оценка слизистой оболочки и прицельная биопсия. Для гистологического исследования брали по два биоптата из слизистой оболочки антрального и фундального отделов и из области угла желудка или луковицы двенадцатиперстной кишки. По одному биоптату для бактериологического исследования и быстрого уреазного теста из тех же мест. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали материал после его гомогенизации и бактериологического посева.

Наличие HP в биоптатах выявляли с помощью гистологического и бактериологического методов, уреазного теста, а также метода ПЦР с определением генов UreC и CagА HP. Кроме этого, в сыворотке крови, взятой из вены, исследовали наличие антител к CagА белку HP методом иммуноферментного анализа (ИФА) и Western-blot.

Гистологический метод. Биопсийный материала фиксировали в 10 % забуференном по Лили растворе формалина, заключали их в парафин и готовили срезы. Подготовленные для гистологического исследования препараты окрашивали по методу Гимзы. HP при этом окрашивались в темно-синий цвет и были хорошо видны как на поверхности эпителия, так и в глубине ямок. При микроскопическом изучении материала оценивали степень обсемененности HP, характеризовали изменения структуры слизистой оболочки различных отделов желудка (атрофия, метаплазия), оценивали взаиморасположение инфекта и ткани, выраженность и активность воспалительной реакции. Для этих целей использовали визуально-аналоговую схему оценки, предложенную M.F. Dixon и соавт. [10].

Быстрый уреазный тест. Это исследование проводили при помощи теста "Pronto Dry" фирмы "Medical Instruments Corporation". "Pronto Dry" - новое поколение быстрого полуколичественного уреазного теста для диагностики инфекции HP в клинической лаборатории. Он состоит из сухой фильтровальной бумаги на которую нанесены мочевина, феноловый красный (индикатор рН) и буфер. Фильтровальные бумажки помещены в запакованный пластиковый пакет (слайд) и имеют желтую окраску. Предварительно снимали этикетку со слайда (ячейка должна быть желтого цвета), после чего в ячейку добавляли воду для смачивания фильтровальной бумаги и обеспечения лучших условий для контакта биопсийного материала. Стерильной иглой переносили полученный биопсийный материал из щипцов эндоскопа на слайд. Слайд с биоптатом помещали в термостат (37? С) на 3 ч для ускорения реакции. Через 3 ч слайд вынимали и держали при комнатной температуре. Результаты теста оценивали через 5 мин, 30 мин, 1 ч и 24 ч. Тест расценивался как положительный при изменении цвета окраски слайда от желтого до ярко красного.

Бактериологический метод. Биоптаты для бактериологического исследования помещали в специальные транспортные среды "Кэри-Блэр", "Bio-Merieux" и доставляли в лабораторию не позднее, чем через 2 ч. Перед посевом на питательные среды проводили ручную гомогенизацию биопсийных образцов в 0,5 мл стерильного физиологического раствора с соблюдением всех правил асептики. Далее производили посев гомогенизата на 2 питательные среды: неселективную (колумбийский агар фирмы "Oxoid", 7,5 % донорской крови) и селективную (колумбийский агар фирмы "Oxoid", 7,5 % донорской крови, цефзулодин 5 мг/ л, ванкомицин 10 мг/л, триметоприм 5 мг/л, амфотерицин 5 мг/л, трифенилтетразолиум хлорид 40 мг /л среды). Чашки инкубировали при температуре 37?С в микроанаэростатах с использованием специальной газовой среды со сниженным парциальным давлением кислорода и увеличенным содержанием CO₂ в течение 3-7 дней. Оптимальный состав газовой среды создавался с помощью пакетов "Campygen" фирмы "Oxoid" [13]. При получении культуры осуществляли ее идентификацию путем изучения морфологических и биохимических характеристик HP.

Метод ПЦР. Определение ДНК HP в биоптатах осуществляли наборами реагентов НПФ "Литех". Для экстракции и очистки ДНК HP кусочек ткани слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки помещали в 100 мкл лизирующего раствора, включающего 10мМ Трис-HCI рН 8,8, 25 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл протеинкиназы К и инкубировали до полного растворения. К раствору добавляли 10 мкл водяной суспензии сорбента и 300 мкл буфера, состоящего из 10мМ Трис НС1 рН 8,0, 5,5 М гуанидинтиоционата, 10 мМ ЭДТА. Суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, периодически встряхивая, после чего осаждали сорбент центрифугированием несколько секунд при 12 тыс. об/мин. Супернатант удаляли с помощью вакуумного насоса, а сорбент дважды промывали 70 % этанолом и высушивали при 60 ?С в течение 10 мин. Очищенную ДНК элюировали 50 мкл деионизированной воды. В качестве мишеней для мультиплекс-ПЦР использовали гены UreC и CagА. Реакцию амплификации проводили в объеме 30 мкл. Реакционная смесь содержала 10 мМ Трис НС1 рН 8,3, 50 мМ КСl, 2 мМ MgCl, 50 мкМ каждого дНТФ, 10пкМ каждого праймера (к гену UreC: прямой 5"-TCACCCCCATGTTTGTGATGCG-3", обратный:5"-GCACGATCCTTAAACTCTGTAAATT-3"; к гену CagА: прямой 5"-ATCAAAAACCAATCGTTGATAAGA-3", обратный: 5"-TCCTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA-3", 1 ед. Taq-полимеразы и 5 мкл анализируемого очищенного образца. Амплификацию проводили в приборе "Gene-Amp 9600" (фирма "Perkin Elmer"). После проведения 40 циклов в режиме: 94 ?С-20 с, 50 ?С-20 с, 72 ?С-45 с, продукты амплификации идентифицировали в 1,5 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Амплифицированный фрагмент гена UreC составлял 492 п.о., фрагмент гена СаgА - 303 п.о.

Определение антител к СаgА белку HP методом ИФА. Исследовали сыворотку, полученную из венозной крови путем центрифугирования. Для определения антител к СаgА белку HP использовали диагностические тест-системы "CagAssay" (Cytotoxin Associated Gene-A) фирмы "Biomerica". При проведении исследований строго придерживались инструкции, прилагаемой фирмой к тест-системе. Положительными, т.е. содержащими антитела к СаgА белку HP, признавались пробы, оптическая плотность (ОП) которых превышала величину положительного Cut-off; отрицательными, т.е. не имеющими антител, - пробы, ОП которых была ниже отрицательного Cut-off.

Метод Western-blot. Сыворотки крови пациентов исследовали с помощью тест-систем "HELICO BLOT 2.1" фирмы "Genelabs Diagnostics". "HELICO BLOT 2.1" позволяет обнаружить антитела к специфическим белкам HP, включая такие антигены, как CagA, VacA, UreA и другие. Кроме специфических антигенов HP на нитроцеллюлезный стрип нанесен рекомбинантный антиген с высокой предсказательной величиной индикации текущей инфекции HP (Current infection marker). Исследовали сыворот- ку венозной крови, полученную путем центрифугирования. При проведении исследований строго придерживались инструкции, прилагаемой к диагностической тест-системе. Результаты исследований расценивались как положительные по следующим критериям:

- 116 кД (CagA) положительный, где CagA должен быть представлен в одной или более полосе; 89 кД (VacA), 37 кД, 35 кД, 30 кД (UreA) и 19,5 кД вместе, или с маркером текущей инфекции;

- присутствие одной полосы в области 89 кД, 37 кД или 35 кД с маркером текущей инфекции или без него;

- присутствие обеих полос в области 30 кД (UreA) и 19,5 кД вместе с маркером текущей инфекции или без него.

Наличие маркера текущей инфекции оценивали как положительный результат, его отсутствие - как отрицательный. Серотипы HP анализировались с помощью программы AutoScan 2.0. При этом получали графическое изображение антигенного профиля HP, по результатам которого различали 4 серотипа в зависимости от наличия или отсутствия антител к антигенам СадА и VacA в сыворотке крови: тип I (СаgА+, VacA+), тип Ia (СаgА+, VacA-), тип Ib (СаgА-, VacA+) и тип II (СаgА-, VacA-) [15, 17].

Далее...