Е. Г. Бочкарев

Институт аллергологии и клинической иммунологии, Москва

В начало...

Показания к выявлению антихламидийных антител классов Ig G, Ig A, Ig M в сыворотке крови методом ИФА.

1 . Определение стадии заболевания:

- острая, первичная;

- хроническая;

- реактивация или реинфекция;

- состояние после реконвалесценции (остаточная серология).

2. Оценка эффективности проводимого лечения (наряду с исследованием культуральным методом и ПЦР).

3. Установление хламидийной этиологии экстрагенитальных поражений (артриты, пневмонии, заболевания глаз).

В промежутке между пятым и двадцатым днями после появления клинических симптомов заболевания последовательно возникают антитела этих трех классов к специфическому хламидийному липополисахариду. Ig M является маркером острой стадии, они определяются уже через пять дней после начала заболевания. В течение 10 дней после появления симптомов заболевания происходит смена IgM на IgА. В течение короткого периода могут одновременно присутствовать Ig M и Ig A. В это же время, или с небольшой задержкой в 2-3 недели, могут быть определены и IgG. Прогрессирование заболевания, переход в хроническую стадию характеризуется появлением Ig A, Ig G- антител ( таблица 1).

Таблица 1. Определение стадии заболевания на основании выявления антител классов IgG, IgA, IgM
Cтадия заболевания	Классы антител
Острая	IgG, IgA, IgM
Хроническая	IgA*, IgG
Реактивация или реинфекция	IgA*, IgM
Cостояние после реконвалесценции	IgG
* - при недостоверном определении титра Ig A подтверждение осуществляется при помощи определения IgM.

Выделение хламидий в культуре клеток МсСоу. Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким, является метод диагностики хламидий путем выделения возбудителя в культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами ("золотой стандарт"). Для этой цели обычно используют чувствительную культуру клеток, обработанную циклогексимидом. Чувствительность культурального метода по сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по специфичности. В литературе описаны случаи выявления хламидии трахоматис методом ПЦР при отрицательных результатах культурального теста и наоборот [1,4].

Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим методом являются:

1. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.

2. Оценка эффективности проведенного антибактериального лечения.

3. Выявление чувствительности и резистентности к антибактериальным препаратам.

4. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии, трансплантации костного мозга; лица, получающие иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом и туберкулезом).

5. Бесплодие неясного генеза.

6. Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.

Культуральный метод является референс-методом при оценке эффективности антибактериального лечения. При исследовании биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых случаях можно получить "ложноположительные с клинической точки зрения" результаты. Это связано с тем, что невозможно однозначно оценить жизнеспособность и патогенность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только данные молекулярно-биологических методов . В этом случае при исследовании клинического материала с помощью культурального посева микробные клетки, потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, не дадут роста в клеточной культуре.

Для транспортировки и хранения клинического материала используют специальную питательную среду (транспортная среда). Клинический материал после перенесения в транспортную среду хранится в общей камере холодильника при температуре +40 С и, в течение двух суток должен быть доставлен в лабораторию.

Процедура заражения клеток

1. Добавление к клеткам ростовой среды, cодержащей циклогексимид.

2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от больных.

3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение 45 минут.

4. Отмывка клеток питательной средой.

5. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36⁰ C.

6. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой иммунофлюоресценции или ПЦР.

Реальный срок получения результатов этим методом - семь дней.

В настоящее время в литературе растет число сообщений о случаях резистентности хламидий к антибактериальным препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в том, что он является пока единственным методом, позволяющим выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.

Схема метода выявления устойчивости хламидии трахоматис к антибактериальным препаратам:

- хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве, заражают чувствительные клетки;

- к зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую антибиотик в различных дозах;

- зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36⁰C;

- чувствительность хламидий к антибиотику определяется по подавлению инфекции в зараженных клетках, то есть по снижению числа клеток с внутриклеточными включениями. Процедура длительная, занимает по времени две недели.

Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции. Дороговизна, длительность и трудоемкость микробиологического выделения хламидий в культуре существенно затрудняет использование этой процедуры в рутинной лабораторной диагностике. В литературе накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР для выявления хламидии трахоматис. Особое внимание при его использовании следует уделять, без сомнения, вопросам правильной интерпретации получаемых результатов. Экстремально высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦР делают эту методику во многом революционной в лабораторной диагностике. Основными мишенями при выявлении хламидии трахоматис являются нуклеотидная последовательность видоспецифической криптической плазмиды, последовательность генома главного белка внутренней мембраны, рибосомальные гены [1,4,13].

Данная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94⁰ С происходит разделение цепей ДНК, затем при 56-58⁰ C - присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК мишени, и при температуре 72⁰ C протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5' -3' . В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями.

По сравнению с широко применяющимися иммунологическими тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ:

- высокой и регулируемой специфичностью, обусловленной лишь нуклеотидной последовательностью, применяемой в данной диагностической системе;

- высокой чувствительностью, позволяющей диагносцировать не только острые, но и латентные инфекции (возможно выявление даже единичных бактерий или вирусов);

- химическим сходством всех нуклеиновых кислот позволяющим разрабатывать универсальные процедуры для выявления различных инфекционных агентов;

- возможностью идентификации возбудителя в течение 4,5-5 часов.

Далее...