Протеолитическая деградация белков в клетке
М. Ермолаева, биологический факультет МГУ.

Каждая соматическая клетка данного организма обладает одинаковым набором генов, кодирующих разнообразные белки. Не все гены активны. Экспрессия многих генов является тканеспецифической - происходит только в клетках, принадлежащих той или иной ткани организма. В случае, если продукты нескольких генов выполняют одну и ту же функцию, клетке вполне достаточно правильной экспрессии одного из них. Экспрессия целого ряда генов запускается в определен-ных условиях - в нужный момент клеточного цикла или под действием соответствующих факторов среды.
Белок выполняет закрепленную за ним функцию, а затем, в определенный момент, клетке необходимо от него избавиться. Последнее обусловлено рядом причин : во - первых, дальнейшая активность белка может навредить клетке, во - вторых, нужно синтезировать новые белки, а перегрузка цитоплазмы полипептидами является источником апоптоза.
Переставшие быть необходимыми, белки подвергаются протеолитической деградации.
Внутриклеточную деградацию белков долгое время считали неспецифическим случайным процессом. Настоящим прорывом в данной области послужило открытие убиквитинового сигнального пути. В рамках этого пути деградации белка, которая осуществляе крупным белковым комплексом - протеосомой, предшествует присоединение к нему "цепочки"молекул небольшого пептида убиквитина. Полиубиквитиновая цепочка навешивается в строго определенный момент и является сигналом, свидетельствующим о том, что данный белок подлежит деградации. Теперь ясно, что процесс внутриклеточного протеолиза жестко регулируется и чрезвычайно важен для множества базальных клеточных функций.
Среди субстратов специфического протеолиза : регуляторы клеточного цикла, компоненты различных сигнальных путей, а также мутантные белки и белки, поврежденные посттрансляционно. Система внутриклеточного протеолиза также принимает участие в презентации антигена в комплексе с MHC (комплексом гистосовместимости) I класса.
Долгое время считали, что вышеупомянутому протеолизу подвергаются лишь белки, локализованные в цитоплазме, допускали возможность протеолиза ядерных белков. Сейчас ясно: система работает также в отношении белков, связанных с мембранами, секретируемых белков (для этого последние должны переместиться из эндоплазматического ретикулума в цитозоль путем обратного транспорта).
Система внутриклеточного протеолиза вовлечена в такие процессы как пролиферация клеток, развитие и дифференцировка, реакция на стресс и патогены, репарация ДНК. Нарушения этой сложной системы являются причиной многих заболеваний.

Стадии убиквитин-зависимого протеолиза
Деградация белка по убиквитиновому пути включает две основные стадии :
1. Ковалентное присоединение к подлежащему деградации белку полиубиквитиновой цепи.
2. Деградация белка 26S протеосомой.

Убиквитин и белки E1 - E3
Убиквитин представляет собой полипептид, содержащий 76 аминокислотных остатков. Присоединение убиквитина к белку происходит в три шага с участием трех групп ферментов - Е1, Е2 и Е3:
1. Фермент Е1 активирует убиквитин : АТФ зависимо формируется макроэргическая связь между С - концевым глицином убиквитина и цистеином белка Е1.
В связи с тем, что процесс активации универсален - одинаков для любого убиквитинового пути, организму достаточно одного варианта Е1.
2. Активированный убиквитин переносится на остаток цистеина белка Е2 ( UBC - ubiquitin conjugating enzyme или UCP - ubiquitin carrier protein). Формируется новая макроэргическая связь.
Клетка содержит несколько вариантов Е2 белков. Например, в геноме дрожжей закодировано тринадцать различных Е2. Один вид Е2 участвует в ограниченном количестве убиквитиновых путей, так как вовлечен в специфическое взаимодейсвие с определенными белками класса Е3 (одним или несколькими).
Существуют Е2, способные переносить убиквитин на субстрат самостоятельно, без участия Е3.
3. Белки класса Е3 представляют собой убиквитин - лигазы, способные специфически связываться с подлежащими деградации белковыми субстратами, напрямую или посредством вспомагательного белка. Е3 катализируют перенос убиквитина с Е2 на субстрат - образование пептидной связи между С - концом убиквитиновой единицы и аминогруппой лизинового остатка субстрата (в случае если это - первая молекула убиквитина, присоединяемая к данному белку) или с лизином-48 предыдущей молекулы убиквитина.
Молекула убиквитина содержит семь остатков лизина. In vivo удалось обнаружить в полиубиквитиновых цепях связывание по 11, 29, 48 и 63 лизинам. Из вышеперечисленного протеосома узнает только цепи, связанные по 48 лизину.
Е3 узнают определенный мотив в составе субстрата, называемый дегроном - на уровне Е3 обеспечивается специфичность протеолиза. В связи с тем, что специфическому протеолизу подвергается огромное количество белков, вариантов Е3 в клетке особенно много.

Узнавание субстратов убиквитин - лигазами
Существуют три принципиальных пути узнавания субстратов убиквитин - лигазами :
1. Узнавание определенного мотива, конститутивно входящего в состав белка. Например, узнается определенный N - концевой аминокислотный остаток ( так называемое N - правило).
Однако присутствие мотива, узнаваемого Е3 (дегрона) в структуре белка не говорит о том, что этот белок обязан деградировать. Обычно дегрон располагается в непосредственной близости от последовательности, ответственной за взаимодействие с субстратом или шапероном, сайта олигомеризации ( в случае, если белок активен в виде олигомера), бывает спрятан соответствующей нативной структурой. Таким образом, если белок правильно свернут и функционально востребован, дегрон будет пространственно не доступен, Е3 не сможет с ним связаться, деградации не произойдет.
2. Узнавание белка, подвергшегося определенной модификации.
Пример : Для активации транскрипционного фактора NF kappa B необходимо фосфорилирование соответствующего ингибитора (I kappa B). I kappa B, образуя комплекс с NF kappa B, маскирует сигнал ядерной локализации, принадлежащий фактору - фактор не может попасть в ядро. Фосфорилированная форма I kappa B узнается соответствующим Е3 и немедленно подвергается протеолизу. В результате NF kappa B высвобождается, перемеща-ется в ядро, принимает участие в регуляции транскрипции.
3. Узнавание субстрата в комплексе с соответствующим адапторным белоком.
Пример : Вирус папилломы человека (HPV) кодирует белок E6 и белок, ассоциированный с Е6 ( E6 - AP). Комплекс Е6 и E6 - AP узнает одновременно проапоптотический белок р53 и убиквитин - лигазу, ответственную за его деградацию.

Рис. 1. Каталитический комплекс протеосомы архей и эукариот (взято из [2]).

Протеосома
26S протеосома состоит из сердцевинного каталитического комплекса 20S, фланкированного с двух сторон регуляторными субъединицами 19S. Молекулярная масса 26S протеосомы - 2МДа.
За рядом исключений 26S протеосома узнает и подвергает протеолизу полиубиквитинированные белки.
20S комплекс построен из четырех колец: (см. рис. 1). Каждое из колец состоит из семи субединиц. Эти субъединицы кодируются 14 генами : семь кодируют разные , семь - разные субъединицы. В - кольцах локализованы три каталитических сайта : сайт, похожий на трипсин ( узнает остатки тирозина и фенилиаланина ), сайт, похожий на химотрипсин ( узнает остатки лизина и аргинина ) и сайт, производящий гидролиз полипептидной цепи после остатка глутамата. Каждый сайт построен из двух, одинаковых - субъединиц, входящих в состав разных колец.
Кроме трех видов - субъединиц, конститутивно формирующих активные центры (входят в число продуктов семи вышеупомянутых генов), существуют их близкие гомологи, закодированные в локусе MHC II. Эти белки экспрессируются в определенных условиях ( например - под действием интерферона) и встраиваются на место конститутивных гомологов в процессе сборки новых протеосом. В результате каталитические свойства протеосомы меняются на уровне соотношения эффективностей активных центров. Общая эффективность протеолиза не изменяется, изменяется качественное соотношение продуктов.
кольца необходимы для стабилизации - колец, а также для связывания 20S субъединицы с 19S кэпирующими комплексами.
19S кэпирующая субъединица состоит из 2-х частей: основания и крышки. Основание отвечает за связывание с 20S, обладает АТФазной активностью. Крышка отвечает за узнавание полиубиквитинированных белков - субстратов .
Непонятно, как именно протеосома взаимодействует с субстратом: как он туда попадает, как выводятся продукты протеолиза.

У прокариот и архей имеются протеосомы, схожие с 26S протеосомой эукариот по строению и механизму действия : так же имеется каталитический цилиндр и две кэпирующие регуляторные субъединицы. При этом с обеих сторон каталитического цилиндра имеются отверстия. У 20S субъединицы 26S протеосомы таких отверстий нет - N-концы a субъединиц переплетаются и заполняют пространство. Кроме того в зоне контакта и колец обнаруживаются небольшие поры, связанные с активными сайтами - возможна перестройка этих пор с образованием просветов, достаточных для проникновения субстрата. Остается также вероятность АТФ - зависимой перегруппировки N-концов a субъединиц в результате ассоциации с 19S комплексами.
20S каталитический цилиндр может ассоциировать с 11S ( РА28 ) кэпирующими комплексами. РА28 представляет собой кольцо состоящее из двух видов субъединиц - и . PA28 не обладает АТФазной активностью. Синтез обоих видов субъединиц индуцируется гамма интерфероном.
Протеосома 11S-20S-11S не может расщеплять интактные белки. Она процессирует пептиды - продукты деятельности 26S протеосомы, которые затем презентируются на поверхности клетки в комплексе с МНС I класса. Описана протеосома вида: 19S-20S-11S. Возможно, она осуществляет двойной процессинг.

Деградация белков, ассоциированных с мембраной
Процессирование белков, ассоциированных с мембраной, отличается от деградации цитоплазматических белков. Не вдаваясь в детали этого процесса, обсудим основные отличия :
1. Деградация осуществляется лизосомами.
2. Для таргетинга белка в лизосомы обычно достаточно моноубиквитинирования. В некоторых случаях формируется полиубиквитиновая цепь.
3. В случае формирования полиубиквитиновой цепи связывание происходит по 63 лизину.

Выщепление убиквитина из аддуктов - процесс, обратный убиквитинированию.
В определенных ситуациях клетке необходимо выщеплять убиквитин из образуемых им аддуктов. Например: необходимо отщеплять убиквитин от продуктов протеолиза, от белков, к которым он присоединился по ошибке. Кроме того, убиквитин синтезируется в виде линейного полипредшественника - необходимо нарезать из него функциональные молекулы. При этом на C-конеце последнего мономера полипредшественника закодирован дополнительный аминокислотный остаток, который необходимо отщепить, так как он блокирует активный глицин. Есть два рибосомальных белка, на N-конце которых закодирован убиквитин. Таким образом обеспечивается таргетинг этих белков к рибосоме. После того, как вышеупомянутые белки включились в рибосомальный комплекс, убиквитин нужно отщепить.
Белки, осуществляющие выщепление убиквитина относятся к тиоловым протеиназам, узнают С-концевой аминокислотный остаток молекулы убиквитина, делятся на два класса:
1. С-концевые убиквитиновые гидролазы (UCH): белки с молекулярной массой порядка 25 кДа, производят котрансляционный протеолитический процессинг убиквитинового предшественника, а также выщепление убиквитина из аддуктов с небольшими молекулами - аминами и тиолами.
2. Убиквитин - специфичные протеазы (UBР), они же - изопептидазы: катализируют выщепление убиквитина из конъюгатов с клеточными белками. Молекулярный вес - порядка 100 кДа. В отличие от UCH, изопептидаз в клетке много. Среди них есть свободные и ассоциированные с 19S комплексом, АТФ-зависимые и не АТФ-зависимые, специфичные к различным субстратам.

Биологический смысл убиквитинирования
Убиквитин - зависимый протеолиз существует только у эукариот (отсутствует у прокариот и архей). В то же время у прокариот и архей есть АТФ - зависимые протеазы, принципиально схожие с 26S протеосомой: состоят из двух кэпирующих субъединиц, ответственных за узнавание субстрата и обладающих АТФазной активностью и каталитической субъединицы - цилиндра. Их основное отличие от 26S протеосомы состоит в том, что кэпирующая субъединица узнает непосредственно субстрат - определенный мотив в структуре белка, говорящий о том, что он подлежит деградации. Из-за этого число потенциальных субстратов ограничено.
Таким образом, первое преимущество убиквитинирования - увеличение числа потенциальных субстратов засчет большого количества ферментов осуществляющих убиквитинирование и возможности их комбинирования.
Другое важное преимущество убиквитинирования состоит в том, что оно обратимо. Для таргетинга белка в протеосому не достаточно одной молекулы убиквитина, нужна мультиубиквитиновая цепь - деградация происходит не сразу и у клетки есть время подумать (kinetic proofreading). Таким образом обеспечивается гибкость системы протеолиза.

Итак, мы рассмотрели, не вдаваясь в детали, процесс убиквитин-зависимой деградации белков в клетке. Этот процесс - один из лежащих в основе сложной системы регуляции жизнедеятельности эукариотической клетки, так как позволяет:
1. В строго определенный момент подвергать специфическому протеолизу огромное количество разнообразных белков.
2. Отменять деградацию, если белок все еще нужен клетке.

Литература
1. Aaron Ciechanover. The ubiquitin - proteasome pathway: on protein death and cell life. EMBO Journal. 1998 Vol. 17 No. 24 pp. 7151-7160
2. George N. DeMartino and Clive A. Slaughter. The Proteasome, a novel protease regulated by multiple mechanisms. Journal of Biological Chemistry 1999 Vol. 274 No. 32 pp. 22123-22126
3. Claudio A. P. Joazeiro and Allan M. Weissman. RING finger proteins : mediators of ubiquitin ligase activity. Cell. 2000 Vol. 102 pp. 549-552
4. Jeffrey D. Laney and Mark Hochstrasser. Substrate targeting in the ubiquitin system. Cell. 1999 Vol. 97 pp. 427-430
5. Rati Verma and Raymond J. Deshaies. A proteasome howdunit : the case of the missing signal. Cell. 2000 Vol. 101 pp. 341-344
6. Sue Wickner et. al. Posttranslational quality control : folding, refolding and degrading proteins. Science. 1999 Vol. 286 pp. 1888-1893