ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОГО АЛГОРИТМА ДЛЯ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ КОРРЕЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ (ФКС)

(г. Пущино, Московская область)

Проведено сравнение различных алгоритмов, применяемых для численного решения уравнения Фредгольма I-го рода, позволяющих восстановить распределение частиц по размерам по корреляционной функции, получаемой методом ФКС.

CHOOSING THE OPTIMUM ALGORITHM FOR THE PROCESSING OF FLUORESCENSE CORRELATION SPECTROSCOPY DATA (FCS)

Kovalev A.E.

(Pushchino, Moscow Region)

Different schemes of the numerical solution of the Fredholm integral equation of the 1-st kind, were compared to find an optimal algorithm for restoring the particles size distribution from correlation function registered in the FCS experiment.

Введение.

В настоящее время метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) получил широкое распространение в биологических исследованиях. Это связано с высокой чувствительностью метода: возможностью работы с нано- и субнаномолярными концентрациями; предоставляемой методом возможностью регистрации флуоресценции из очень малого объема: порядка 10^-15 литра; возможностью определения подвижности флуоресцирующих частиц в широком диапазоне: от микросекунд (соответствующих структурным переходам) до секунд (соответствующих подвижности бактериальных клеток в вязких растворах); быстрым временем измерения: за десятки секунд можно судить об изменениях флуоресценции в исследуемом объеме и природе этих изменений. Метод ФКС регистрирует корреляционную функцию (КФ) флуктуаций флуоресценции в конфокальном объеме. Анализ КФ позволяет определить абсолютное число флуоресцирующих частиц и их подвижность в растворе, то есть охарактеризовать распределение частиц по размерам, а также скорости внутримолекулярных конформационных переходов.

ФКС нашла применение в иммунологии для высоко-специфичного обнаружения комплекса антиген-антитело, при наличии хотя бы 10⁷ молекул антигена на микролитр [1] и в диагностике болезни Альцгеймера для обнаружения единичных агрегатов амилоидного b-протеина в цереброспинальной жидкости [2], для изучения взаимодействия лиганд-рецептор [3,4] и анализа взаимодействия шаперона GroEL с субстратом [5], конформационных перестроек ДНК в водном растворе [6] и Н⁺-АТФазы при связывании с нуклеотидами [7], спонтанного протонирования- депротонирования флуоресцирующего центра у белков, обладающих зеленой флуоресценцией (GFP, EGFP) [8], для анализа рестрикции ДНК в наномолярной концентрации в объеме одного микролитра [9]. Нашла свое применение ФКС и для внутриклеточных исследований. Несколько таких задач описаны в [10].

Данная работа посвящена поиску оптимального, в смысле качества и скорости оценки, алгоритма для восстановления функции распределения частиц по размерам на основании корреляционной функции, полученной методом ФКС. Аналогичная задача возникает при интерпретации экспериментальных данных ядерного магнитного резонанса, рентгеноструктурного анализа, восстановления изображения и многих-многих других приложений, где искомые величины не могут быть определены с помощью метода наименьших квадратов.

Постановка задачи.

Метод ФКС является непрямым методом. Для нахождения функции распределения частиц по размерам необходимо решить уравнение Фредгольма первого рода. Точность восстановления этого распределения во многом определяется качеством подгонки КФ. В разных лабораториях данные ФКС обрабатывают различными программами. Мы попытались сравнить алгоритмы, применяемые для численного решения подобных уравнений, с целью выбора наиболее подходящего для анализа КФ.

Запишем уравнение Фредгольма I-го рода для нашего конкретного случая:

(1)

где f(t) - функция, учитывающая распределение частиц по размерам (определяющим их скорость диффузии) и вклады от процессов более быстрых, чем броуновская диффузия, K(t,t) - ядро свертки, f(t) - регистрируемая КФ со случайным шумом ε(t), s - структурный параметр, характеризующий геометрию конфокального объема.

Рис. 1. Функция распределения, определенная разными алгоритмами.

Сформулируем основные особенности уравнения (1) и функции распределения. Функция распределения должна быть неотрицательной, устойчивой к малым изменениям параметров, используемым при решении и не содержать экстра-пиков. Ядро уравнения (1) не содержит шумов, а КФ может быть существенно искажена случайными шумами.

Результаты и обсуждение.

Исследование итерационного алгоритма Твоми [11], модифицированного Франкен [12] и алгоритма, предложенного Ощепковым [13], показало, что алгоритм Ощепкова менее чувствителен к начальным условиям, но имеет более медленную сходимость. Вместе с тем, оба метода позволяют строить положительноопределенные решения. К сожалению, даже при числе итераций более 1000 данные алгоритмы не дают решения, обеспечивающего желаемую точность решения (рис. 2б). Функции распределения, а как следствие и КФ, получаемые с их помощью, выглядят слишком сглаженными.

Рис. 2. а - разность между измеренной КФ и рассчитанной по алгоритму [19],
б - разность между рассчитанной по алгоритму [19] и обозначенной в легенде КФ. (относительная ошибка определялась как отношение изображаемой разности к максимальному значению измеренной КФ)

Рассматривалась также группа регуляризующих методов: Тихонова [14] с выбором оптимального значения регуляри-зу-ющего параметра при помощи алгоритма Морозова [15]; TSVD метод [16]; ν-метод [17]; метод максимальной энтропии [18]. Из рассмотренных только метод максимальной энтропии дает возможность построить неотрицательные решения, а метод Тихонова обеспечивает наилучшее приближение КФ, давая, тем не менее, отрицательное значение для функции распределения частиц.

Метод наименьших квадратов, с введением дополнительного условия на неотрицательность решения [19], обеспечивает самую точную подгонку КФ (рис. 2а), но в решении при этом появляются дополнительные пики. От них можно избавиться, введя регуляризующее условие. Для этого мы воспользовались алгоритмом, предложенным Provencher [20]. Как можно видеть из приведенных рисунков (рис. 1 и рис. 2), данный алгоритм позволяет найти компромиссное неотрицательное решение, удовлетворяющее как по качеству подгонки КФ, так и по отсутствию экстра-пиков в функции распределения.

Все алгоритмы проверялись посредством программ, написанных на Microsoft (C) Fortran или в среде MATLAB.

Список литературы:

1.Foldes Papp Z, Demel U, Tilz GP / Proc Natl Acad Sci USA 2001 Sep 25 98:20 11509-14

2.Pitschke M, Prior R, Haupt M, Riesner / Nat Med 1998 Jul 4:7 832-4

3.Wohland T, Friedrich K, Hovius R, Vogel H / Biochemistry 1999 Jul 6 38:27 8671-81

4.Schuler J, Frank J, Trier U, Schafer-Korting M, Saenger W / Biochemistry 1999 Jun 29 38:26 8402-8

5.Pack CG, Nishimura G, Tamura M, Aoki K, Taguchi H, Yoshida M, Kinjo M / Cytometry 1999 Jul 1 36:3 247-53

6.Bonnet G, Krichevsky O, Libchaber / Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Jul 21 95:15 8602-6

7.Borsch M, Turina P, Eggeling C, Fries JR, Seidel CA, Labahn A, Graber P / FEBS Lett 1998 Oct 23 437:3 251-4

8.Haupts U, Maiti S, Schwille P, Webb WW / PNAS USA 1998 Nov 10 95:23 13573-8

9.Kinjo M, Nishimura G, Koyama T, Mets, Rigler R / Anal Bioch. 1998 Jul 1 260:2 166-72

10.Widengren J, Rigler R / Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 1998 Jul 44:5 857-79

11.Twomey S / J. Comp. Phys. 1975 Vol. 18, pp. 188-200

12.Franken D. / J. Aerosol Sci. 1997, Vol. 28, Suppl. 1, pp. 275-276

13.Ощепков С.Л., Дубовик О.В. / Физика атмосферы и океана, март-апрель 1994, том 30, номер 2.

14.Тихонов A.H. / ДАН CCCP, 1963, т.153, N 1.

15.Морозов B.A. / ЖВМ и МФ, 1973, т.13, N 5.

16.Hansen P.C. The truncated SVD as a method for regularization. BIT, 1987, 27, 543-553.

17.Hanke M. / J. Numer. Funct. Anal. Optim. 1992, 13, 523-540.

18.Fierro R.D., Bunch J.R. / SIAM J. Matrix Anal. Appl., 1994, 15, pp. 1167-1181.

19.Charles L. Lawson, Richard J. Hanson Solving Least Squares Problems. SIAM Press 1995

20.Provencher S.W. Comput. Phys. Commun. 1982, 27, 213