Введение.

Первичные (световые) стадии фотосинтеза зеленых растений включают сложную систему процессов электронного транспорта, осуществляемых рядом высокоспециализированных мультиферментных мембранных комплексов и подвижных переносчиков электрона, локализованных в мембранах тилакоидов в хлоропластах зеленых растений и водлорослей. Для исследования механизма этих процессов традиционно применяются методы математического моделирования [15].

В настоящей работе мы предлагаем кинетическое описание каталитического цикла фотосистемы 2 (ÔÑ2), как изолированного, так и интегрированного в более полную систему первичных процессов. Модель применена для описания начального участка кривой индукции флуоресценции хлорофилла, моделированию которого посвящено большое количество работ [1,2,3,14]. В рамках модели выведена формула, задающая зависимость интенсивности флуоресценции хлорофилла от концентрации состояний комплекса ФС2 и от компонентов электрохимического потенциала на мембране тилакоида. Показано, что все особенности начального участка индукционной кривой флуоресценции не могут быть описаны в рамках модели изолированной ФС2. Была исследована форма кривой индукции флуоресценции при разных значениях разности электрического потенциала и градиента рН на мембране тилакоида. Построена и исследована компартментальная модель тилакоида, объединяющая блок ФС2 с цитохромным комплексом, фотосистемой 1, а также ионными потоками. Показано, что такая модель тилакоида хлоропласта зеленых растений позволяет описать особенности быстрого участка индукции флуоресценции.

 

Кинетическая модель фотосистемы 2.

Полная математическая модель. В нашей модели мы рассматриваем ФС2 как мембранный фермент, который под действием света катализирует восстановление пластохинона до пластохинола, а также создает трансмембранный градиент электрохимического потенциала протонов, , который затем используется для синтеза АТФ.

Кинетическое состояние ФС2 определяется состоянием четырех входящих в ее состав переносчиков электрона, а именно: хлорофилла P680, феофитина (Phe), первичного одноэлектронного ковалентно связанного хинонного акцептора (Q_A) и центра связывания вторичного акцептора пластохинона (Q_B). Модель содержит 28 кинетических состояний. Все эти состояния и возможные переходы между ними представлены на схеме полного каталитического цикла ФС2 (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема кинетических состояний ФС2. Chl - весь хлорофилл ФС2, включая пигменты светособирающего комплекса и Р680. Phe - первичный электронный акцептор феофитин, Q_{A -} первичный хинонный акцептор электронов, Q_B - центр связывания вторичного электронного акцептора пластохинона. Показано условное разделение процессов на медленные (< 100 мксек - сплошные стрелки) и быстрые (> 1 мсек - пунктирные стрелки). Замкнутые пунктирные линии объединяют состояния ФС2 в новые переменные согласно преобразованиям (5).

После длительной темновой адаптации P680 полностью восстанавливается, а феофитин и Q_A, напротив, переходят в окисленное состояние. Следовательно, перед включением света ФС2 может находится только в двух состояниях, x₁ и g₁, между которыми устанавливается равновесие (реакция 34). Равновесные концентрации этих состояний полностью определяются константой связывания и суммарной концентрацией пластохинона, PQ, в мембране.

После включения освещения P680 переходит в возбужденное состояние, x₂ и g₂ (реакции 1 и 28, соответственно), с последующей передачей электрона на феофитин (реакции 2 и 29), то есть происходит первичное разделение зарядов. Так как электрон не может стабилизироваться на феофитине, то происходит его дальнейшая передача на Q_A (реакции 3 и 30). Далее, система расщепления воды ( СРВ ) донирует электрон окисленному пигменту, приводя его в первоначальное (т.е. восстановленное и невозбужденное) состояние x₅ и g₅. Каждые четыре акта восстановления окисленного P680 комплексом СРВ сопровождаются поглощением двух молекул H₂O, выделением одной молекулы молекулярного кислорода и четырех протонов, во внутритилакоидное пространство, которое при этом заряжается положительно. В нашей модели мы не рассматривали молекулярный механизм функционирования СРВ, а предположили, что на каждый электрон, переданный от СРВ на окисленный P680, во внутритилакоидное пространство выделяется один протон (реакции 4 и 31). Таким образом, последовательность стадий (1-4) или (28-31) приводит к образованию так называемых 'закрытых' реакционных центров (РЦ) с восстановленным Q_A. Дальнейшее освещение закрытых РЦ может приводить к повторному возбуждению пигмента (реакции 5 и 32) и первичному разделению зарядов (реакции 6 и 33). В результате этих процессов образуются состояния ФС2 с окисленным пигментом и восстановленными феофитином и Q_A, т. е. x₇ и g₇, которые являются высокоэнергетическими. Нестабильный заряд на феофитине может рекомбинировать с электронной дыркой на Р680⁺ двумя способами: либо приводя к репопуляции возбужденных состояний Р680* (переход состояний с индексом 7 в состояния с индексом 6), либо непосредственно в основное состояние, путем безызлучательной рекомбинации первичной пары (переход состояний с индексом 7 в состояния с индексом 5 изображен на схеме пунктирными стрелками без номера). В настоящее время нет единого мнения о том, какой из этих путей действительно реализуется [8].

В любом из состояний g_i, i=1,...7, может происходить связывание пластохинона с Q_B центром ФС2 (реакции 34 - 40) с образованием соответствующих состояний x_i, i=1,...7. Связанный пластохинон является двухэлектронным переносчиком и, следовательно, может последовательно акцептировать два электрона, пришедшие на Q_A (перенос первого электрона с на Q_B описывается реакцией 7). Реакция 14 соответствует переносу электрона с на семихинон, расположенный в сайте Q_B с образованием полностью депротонированного пластохинола, . Далее, под действием света в ФС2, в Q_B сайте которой связан депротонированный пластохинол (соответствующие состояния ФС2 обозначены буквами z_i, i=1,...7) происходит уже описанная выше последовательность событий, приводящая к восстановлению Q_A (реакции 15 - 20). Наряду с этим, в каждом из состояний z_i, i=1,...7, может происходить высвобождение пластохинола с предварительным поглощением двух протонов, , из стромы хлоропласта (которая при этом заряжается отрицательно) и образованием первоначальных состояний g_i, i=1,...7, с пустым сайтом Q_B (реакции 21-27), что и замыкает каталитический цикл фотосистемы 2.

Величины x_i, y_i, z_i, g_i, i=1,...7, являются переменными модели, то есть определяются системой дифференциальных уравнений типа :

(1),
соответствующей схеме каталитического цикла ФС2, изображенной на рис. 1. Концентрации протонов во внутритилакоидном пространстве, , строме хлоропласта, , разность электрических потенциалов на мембране тилакоида, DY, а также внутримембранные концентрации пластохинона и пластохинола являются параметрами модели. Скорости всех реакций задаются с помощью закона действующих масс и являются функциями переменных и параметров модели. Для полного описания каждой реакции достаточно знать ее константу равновесия и константу скорости обратной реакции. При заданном конкретном значении константы равновесия K_eqⁱ, константа скорости прямой реакций (k_i) выражается через константу скорости обратной реакции (k_-i) следующим образом:

 

(2)

Константы равновесия окислительно-восстановительных реакций определяются из экспериментально полученных данных по среднеточечным редокс потенциалам.

Стадии 1, 5, 8, 12, 15, 19, 28 и 32 являются световыми и описывают процесс перехода Chl в возбужденное состояние Chl* (константы , i=1,5,8,12,15,19,28,32) и обратный ему процесс дезактивации возбужденного состояния (константы c_i, i=1,5,8,12,15,19,28,32). Константы пропорциональны интенсивности света [4]: ( ~ I×s, где I - интенсивность света, s - поперечное сечение поглощения ФС2.). В частности, при отсутствии освещения, все эти константы равны нулю. Дезактивация возбужденных состояний Chl* сопровождается излучением флуоресценции (хотя возможны и другие пути дезактивации, в нашей работе не рассматриваемые).

В рамках нашей модели функция для расчета величины флуоресценции была представлена в виде суммы концентраций флуоресцирующих состояний ФС2 (то есть состояний с возбужденным Chl), умноженных на соответствующие им константы флуоресценции c_i:

 

(3)

Любая стадия, включающая перенос электрического заряда через мембрану, продуцирует мембранный потенциал (DY), который, в свою очередь, влияет на константу равновесия и константы скоростей всех электрогенных стадий [5, 6, 7]:

 

K_eq(DY)=exp(-a×DY/(RT/F))×K_eq,

k₊(DY)=exp(-d×a×DY/(RT/F))×k₊, (4)
k_-(DY)=exp((1-d)×a×DY/(RT/F))×k_- .

 

Здесь a×DY - тот мембранный потенциал, который генерируется рассматриваемой стадией при переносе заряда через мембрану, d - та часть мембранного потенциала (a×DY), которая влияет на константу скорости прямой реакции.

 

Редуцированная математическая модель. В предыдущем подразделе мы построили полную математическую модель ФС2 (рис. 1). Все процессы, изображенные на этом рисунке могут быть условно разделены на быстрые (с характерным временем менее 100 мксек) и медленные (с характерным временем не менее 1 мсек). К медленным реакциям относятся все световые стадии перехода P680 в возбужденное состояние (реакции 1, 5, 8, 12, 15, 19, 28, 32), а также связывание пластохинона (реакции 34 - 40) и диссоциации пластохинола (реакции 21 - 27). Все остальные реакции являются быстрыми. Таким образом, возникает возможность проведения редукции быстрых процессов в полной математической модели ФС2.

Перейдя к пределу по константам скоростей быстрых реакций, делая замену переменных:

 

, ,

, , (5)
,

, , , ,

 

выражая старые переменные через новые, приходим к системе дифференциальных уравнений для новых 'медленных' переменных. На схеме рис.1. замкнутыми пунктирными линиями показаны состояния ФС2, сгруппированные проведенной редукцией в новые переменные согласно преобразованиям (5).

Полностью процесс получения редуцированной системы дифференциальных уравнений приведен в работе [9].

Численное решение системы дифференциальных уравнений производилось с помощью пакета SCAMP. Была разработана исследовательская среда (Borland C++ 4.0, Windows95), которая: (1) накапливала численные решения, полученные в пакете SCAMP, (2) позволяла модифицировать параметры исследуемой модели перед очередным расчетом, (3) выводила данные, накопленные в результате расчетов при изменяемых параметрах, в виде графических зависимостей на экран. При выводе на экран кинетических зависимостей использован логарифмический масштаб времени.

 

Результаты и обсуждение.

Разработанную модель мы применили к описанию одного из широко известных эксперментальных феноменов - кривой индукции флуореценции хлорофилла, которая представляет собой увеличение интенсивности флуоресценции объекта в ответ на включение освещения после периода темновой адаптации. Особенности кинетики индукции флуоресценции зеленых растений хорошо изучены, например, в работах [10,11]. Наиболее характерным участком индукционной кривой является так называемая быстрая фаза (OIDP - участок) - увеличение выхода флуоресценции до максимального значения за времена порядка нескольких секунд. Согласно современным представлениям, ее отдельные кинетические компоненты соответствуют протеканию различных процессов в фотосинтетическом аппарате растения [12] : увеличению концентрации восстановленного Q_A, возрастанию электрического потенциала на мембране тилакоида, изменению редокс состояния пластохинонового пула и т.п.

Одной из главных целей нашей работы была проверка гипотезы о возможности объяснить наблюдаемую в эксперментах немонотонность OIDP кинетики, опираясь исключительно на регуляторные свойства самой фотосистемы 2. Мы попытались выяснить, может ли кривая индукции флуоресценции, построенная на основе нашей модели, иметь в диапазоне 10-500 мсек характерную немонотонность: локальный минимум или по крайней мере 'плечо', которые наблюдаются на экспериментально полученных кривых [10, 11]. Для этого мы исследовали модельные кривые индукции флуоресценции при разных значениях параметров модели.

Результаты моделирования показали, что при различных значениях параметров модели кривая индукции флуоресценции всегда имеет характерную S-образную форму (рис. 2). Никакого локального минимума или 'плеча' на этапе быстрого возрастания флоуресценции не наблюдается. Варьирование параметров модели ведет лишь к изменению стационарного уровня флуоресценции и, в ряде случаев, к изменению скорости его достижения.

Так, увеличение световой константы k_L, повышает стационарное значение флуоресценции и сокращает время, за которое оно достигается (рис. 2а). Напротив, закисление стромы и внутритилакоидного пространства, которое приводит к отклонению от нормальной разности протонного градиента, DpH, равного 2 (pH_n =8, pH_p =6) обусловливает снижение стационарного уровня флуоресценции (рис. 2 б).

Результаты проведенного нами исследования позволяют сделать вывод о том, что наблюдаемые на начальном участке индукционной кривой эффекты немонотонности не являются прямым следствием процессов, протекающих внутри комплекса фотосистемы 2. Происхождение этих эффектов, по всей видимости, следует искать во взаимодействии ФС2 с другими первичными процессами фотосинтеза - генерацией электрохимического потенциала на мембране тилакоида и сопутствующими ей трансмембранными ионными потоками. Имеются данные, что выход флуоресценции в быстрой фазе индукции флуоресценции может зависеть от редокс-состояния пула пластохинонов [10,11].

 

Рис. 2. Индукция флуоресценции, рассчитанная в модели ФС2. (а)При изменении интенсивности светового возбуждения: (1) k_L =10, (2)k_L =30, (3)k_L =100. (б)Для различных рН стромы (pH_n) и люмена (pH_p) тилакоида: (1)рH_n =7, pH_p =6, (2)рH_n=8, pH_p=5, (3)рH_n=8, pH_p=6, (4)рH_n=7, pH_p=5. Указаны параметры модели, неизменные для каждого расчета.

 

В настоящее время продолжается построение и исследование модели тилакоида, объединяющей функциональные блоки, соответствующие молекулярным комплексам, а также подвижным переносчикам электронов, включенным в процесс трансформации энергии световых стадий фотосинтеза: описанная выше модель ФС2, цитохромный комплекс b₆f, пул плаcтохинолов, подвижный переносчик пластоцианин, фотосистема 1, комплекс АТФ-синтетазы, ионные каналы, осуществляющие перенос H⁺, K⁺, Cl⁺ через мембрану тилакоида.

Рис.3. Кинетический ответ модели тилакоида в логарифмическом масштабе времени. (а) Для двух значений интенсивности светового возбуждения (k_L(1)=8, и k_L(2)=16) представлены : кривые индукции флуоресценции FL1 и FL2, изменение во времени электрического потенциала pot1 и pot2, и изменение рН (люмен - рНр1 и рНр2, строма - рНn1 и рНn2 ). (б) Кривые индукции флуоресценции FL1, FL2 и FL3 для трех значений интенсивности светового возбуждения (k_L(1)=20, k_L(2)=40 и k_L(3)=80). На кривой FL3 даны обозначения характерных фаз OIDP-кинетики.

 

На рис. 3 приведены результаты расчета кинетического ответа модели тилакоида на ступенчатое включение постоянного света после темновой адаптации. Рис. 3а показывает одновременно как индукцию флуоресценции (кривые FL1 и FL2), так и изменение величины трансмембранного электрохимического потенциала. Величина электрического потенциала (DY) отражает распределение объемного заряда в компартментах люмена и стромы тилакоида и описывается кривыми pot1 и pot2 . Изменения концентрации ионов водорода в люмене и строме определяются кривыми изменения рН (люмен - рНр1 и рНр2, строма - рНn1 и рНn2 ).

На рис. 3б показан результат расчета для модели тилакоида индукции флуоресценции в широком диапазоне световых констант. Такой компьютерный эксперимент позволяет подойти к моделированию эффектов светового насыщения индукции флуоресценции, экспериментально исследованных в [10, 11].

Результаты компьютерных экспериментов на более полной модели фотосинтетических процессов, включающей модель ФС2, как один из блоков, позволяют описать индукционные кривые с характерной немотонной OIDP-кинетикой. Как было показано выше, это невозможно в рамках модели изолированной ФС2.

Разрабатываемая нами модель дает возможность анализировать взаимосвязь и взаимовлияние потоков энергии и вещества в первичных процессах фотосинтеза.

 

Литература.

1.     Baake E., Shloeder J.P. - 1992. Bull. Math. Biol. 54. - Р.999-1021

2.     Renger G. and Shulze A. Photobiochem. Photobiophys. 9. - 1985. - Р.79-87.

3.     Trissl H.-W., Gao Y. And Wulf K. - 1993. Biophys.J. 64. - Р.974-988.

4.     Молекулярные механизмы трансформации энергии в первичных процессах фотосинтеза // Итоги науки и техники, сер. Биофизика. - 1987. - Т.20.

5.     Демин О.В., Вестерхофф Х.В., Холоденко Б.Н. Биохимия 63. - 1998. - Р.755-772.

6.     Скулачев В.П., Козлов И.А. Протонные аденозинтрифосфатазы: молекулярные биологические генераторы тока. - М.: Наука, 1977.

7.     Reynolds I.A., Johnson E.A. and Tanford C. - 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82. - Р.6869-6873.

8.     Leibl W., Breton J., Deprez J. and Trissl H.W. - 1989. Photosynth. Res. 22. - Р.257-275.

9.     Лебедева Г.В., Беляева Н.Е., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б., Демин О.В. Кинетическая модель фотосистемы II высших растений // Физ. химия, в печати.

10.  Neubauer C., Schreiber U. Z. Naturforsch. - 1987. 42. Р.1246-1254.

11.  Strasser R.J., Srivastava A. Govindjee (1995). Photochemistry and photobiology. 61. - No 1. - Р. 32 - 42.

12.  Dau H. - 1994. J.Photochem. Photobiol. B: Biology 26. - Р.3-27.

13.  Принципы регуляции и модельные системы первичных процессов фотосинтеза // Итоги науки и техники, сер. Биофизика. - 1987. - Т.22.

14.  Кукушкин А.К., Караваев В.А. Теоретические исследование процессов миграции энергии и электронного транспорта в фотосинтезе высших растений // Биофизика. - 1979. - Т.24. - Вып. 1. - С.92-95.

15.  Ризниченко Г.Ю. Математические модели первичных процессов фотосинтеза. Итоги науки и техники, сер. Биофизика. - 1991. - Т.31.