Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://www.enzyme.chem.msu.ru/eduproc/prac/task9/part09.doc Дата изменения: Fri Feb 13 20:44:52 2004 Дата индексирования: Mon Oct 1 23:24:58 2012 Кодировка: koi8-r

ГЛАВА9.

Тушение флуоресценции


Тушением флуоресценции называют любые процессы, которые уменьшают
интенсивность флуоресценции данного вещества. К тушению может проводить
множество процессов, в том числе реакции в возбужденном состоянии, перенос
энергии, образование комплексов и тушение при столкновениях. Эта глава
посвящена главным образом тушению, связанному со случайными столкновениями
между флуорофором и тушителем, которое называется динамическим, или
тушением при столкновениях. Мы также рассмотрим статическое тушение,
которое связано с образованием комплекса. Статическое тушение часто
является осложняющим фактором в анализе динамического тушения. В дополнение
к процессам, упомянутым выше, может встречаться кажущееся тушение
вследствие оптических свойств образца. Например, высокая оптическая
плотность или мутность могут приводить к уменьшению интенсивности
флуоресценции. Это тривиальный тип тушения, который несет мало информации о
молекулярных процессах. В данной главе предполагается, что не эти
тривиальные эффекты определяют наблюдаемые изменения интенсивности
флуоресценции.
Тушение флуоресценции широко изучено как в теоретическом аспекте, так
и в приложении флуоресценции к биохимическим проблемам, причем приложения
связаны со свойствами процесса тушения. Для тушения (и статического, и
динамического) требуется контакт между молекулами флуорофора и тушителя. В
случае динамического тушения тушитель должен диффундировать к флуорофору в
течение времени нахождения в возбужденном состоянии. В результате контакта
флуорофор возвращается в основное состояние без излучения фотона. В случае
статического тушения между флуорофором и тушителем* образуется комплекс,
который не флуоресцирует. В любом случае, чтобы произошло тушение,
флуорофор и тушитель должны контактировать. Это - основное требование,
которое проявляется в различных приложениях тушения. Например, измерением
тушения можно выявить доступность флуорофоров для тушителей. Если данный
растворитель очень вязок, то диффузия замедляется и тушение ослабевает.
Следовательно, изучив тушение, можно определить скорости диффузии
тушителей. Предположим, флуорофор связан либо с белком, либо с мембраной.
Если белок или мембрана непроницаемы для тушителя и флуорофор локализован
внутри макромолекулы, то не может быть ни динамического, ни статического
тушения. Исходя из этих соображений, тушение можно использовать для
выяснения локализации флуорофоров в белках и мембранах и их проницаемости
для тушителей.
*В основном состоянии, до поглощения возбуждающего флуоресценцию
фотона.
Прим. ред
Другой важный аспект динамического тушения - увеличение объемов и
расстояний в растворе, влияющих на экспериментальные данные, которыми
являются интенсивность или время затухания флуоресценции.
Среднеквадратичное смещение (?х2)1/2, на которое тушитель может
продиффундировать за время жизни возбужденного состояния ?, составляет
(?х2) = 2D?, где D - коэффициент диффузии. Рассмотрим молекулу кислорода в
воде при 25њС (D = 2,5 . 10-5 см2/с). В течение типичного времени
затухания флуоресценции (4 нс) молекула кислорода может продиффундировать
на 44 е. Если время затухания длительнее, может наблюдаться диффузия на еще
большие расстояния. Например, для времен затухания 20 и 100 не средние
расстояния диффузии кислорода составляют 100 и 224 е соответственно. Так
как одного диффузионного столкновения с кислородом достаточно для тушения
большинства флуорофоров, измерение тушения флуоресценции выявляет диффузию
тушителей на сравнительно больших расстояниях. Эту ситуацию можно
сопоставить с релаксацией растворителя. Спектральные сдвиги, связанные с
переориентацией молекул растворителя, определяются главным образом
сольватной оболочкой, непосредственно соседствующей с флуорофором.

9.1. Тушители флуоресценции
Изучению тушения благоприятствует то, что многие вещества действуют
как тушители флуоресценции. Один из наиболее известных динамических
тушителей - молекулярный кислород [1], который тушит флуоресценцию почти
всех известных флуорофоров. Чтобы получить достоверные значения квантовых
выходов или времен затухания флуоресценции, для многих образцов часто
бывает необходимо удалить растворенный кислород. Механизм, по которому
кислород тушит флуоресценцию, был предметом многочисленных исследований, и
в настоящее время ясно, что для тушения необходим контакт между молекулами
кислорода и флуорофора. Ароматические и алифатические амины - эффективные
тушители для флуоресценции большинства незамещенных ароматических
углеводородов [2]. Например, флуоресценция антрацена эффективно тушится
диэтиланилином. В этом случае тушение происходит за счет образования
комплекса с переносом заряда*. Флуорофор в возбужденном состоянии
акцептирует электроны амина. В неполярных растворителях часто наблюдается
флуоресценция комплекса с переносом заряда (эксиплекса), и этот процесс
можно рассматривать как реакцию в возбужденном состоянии, а не как тушение.
В полярных растворителях излучение эксиплекса обычно потушено, так что
взаимодействие флуорофор - амин проявляется как истинное тушение. Другие
диффузионные тушители: ксенон [3], пероксид водорода [4], акриламид [5],
ВгО -4 [6], I-[7], оксид диазота, нитрометан [8], нитроксиды [9, 10].
Тушителями являются даже некоторые олефины [11 - 13] и стерически
затрудненные насыщенные углеводороды [14], Например, ?-цианонафталин
тушится некоторыми олефинами. В дополнение к вышеперечисленным соединениям
в качестве диффузионных тушителей можно назвать многие галогенсодержащие
вещества: хлороформ, трихлорэтанол [15], бромбензол [16], хлорид метилртути
[17] и различные соединения, содержащие более одного атома хлора [18].
Тушение тяжелыми галогенами, такими, как бромид и иодид, может быть
результатом интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние,
ускоряющейся за счет спин-орбитального взаимодействия возбужденного в
синглетном состоянии флуорофора и галогена [19 ]. Так как испускание из
триплетного состояния медленное, то оно сильно тушится другими процессами.
Однако для хлорсодержащих веществ механизм тушения, вероятно, другой.
Индол, карбазол и их производные уникально чувствительны к тушению
хлорированными углеводородами [18] и акцепторами электронов, такими, как
протоны, гистидин, цистеин, NО3-, фумарат, Cu2+, Pb2+, Cd2+ и Мn2+ [20].
Тушение этими веществами, вероятно, включает перенос электрона от
флуорофора на тушитель. Кроме этого, индол, триптофан и их производные
тушатся сукцинимидом, дихлорацетамидом, гидрохлоридами пиридина и
имидазола, метионином, Eu3+, Ag+ и Cs+ [21]. Следовательно, множество
тушителей пригодно для изучения флуоресценции белков, в особенности при
рассмотрении поверхностной доступности триптофановых остатков и
проницаемости белков для тушителей.
Тушителями могут быть также пурины, пиримидины [22, 23], N-
метилникотинамиды и N-алкилпиридиниевые и пиколиниевые соли [24, 25].
Например, флуоресценция флавинадениндинуклеотида (FAD) и восстановленного
никотинамидадениндинуклеотида (NADH) тушится адениновой частью молекулы.
Тушение флуоресценции флавина происходит вследствие как статических, так и
динамических процессов, в то время как тушение дигидроникотинамида является
в основном динамическим. Эти ароматические соединения проявляют
______________________________________
* В возбужденном электронном состоянии.
. Прим. ред.
______________________________________
склонность к образованию комплексов с переносом заряда, что и вызывает
тушение флуоресценции. В зависимости от точной структуры изучаемых
соединений внутримолекулярный комплекс в основном состоянии может быть
достаточно устойчивым. Вследствие этого в FAD и NADH часто наблюдается и
динамическое, и статическое тушение.
Из-за того, что многие вещества могут действовать как тушители, часто
можно легко подобрать комбинацию флуорофор - тушитель для решения
поставленной задачи. Важно отметить, что не все флуорофоры тушатся любыми
перечисленными выше веществами. Этот факт иногда можно использовать для
селективного тушения определенного флуорофора. Эффект тушения зависит от
его механизма, обусловленного структурой индивидуальных молекул. Детальный
анализ механизма тушения сложен. В этой главе мы займемся главным образом
природой явления, т.е. выяснением того, является ли природа тушения
динамической или статической. В последней части главы будет приведено
несколько наиболее информативных биохимических приложений эффекта тушения.

9.2. Теория динамического тушения
Динамическое тушение флуоресценции описывается уравнением Штерна -
Фольмера:
(9.1)

где F0 и F - интенсивности флуоресценции в отсутствие и в
присутствии тушителя соответственно; kq - биомолекулярная константа
скорости тушения; ?0 - время затухания флуоресценции в отсутствие тушителя;
[Q] - концентрация тушителя; Кдин = kq ?0 - штерн-фольмеровская константа
тушения. Данные по тушению обычно представляют в координатах F0/F от [Q],
поскольку F0 /F, как ожидается, должно линейно зависеть от концентрации
тушителя. График дает, отсекаемый отрезок на оси у, равный единице, и
наклон, равный Кдин (рис. 9.1). Полезно отметить, что Кдин-1 равна
концентрации тушителя, при которой F0/F = 2, т.е. тушится 50% интенсивности
флуоресценции. Прямолинейная зависимость в координатах Штерна - Фольмера
обычно указывает на существование в растворе одного типа флуорофоров,
одинаково доступных для тушителя. Если присутствуют два типа флуорофоров и
один из них недоступен для тушителя, то штерн-фольмеровский график
отклоняется от линейности в сторону оси х. Такой результат часто
встречается при тушении флуоресценции триптофана в белках полярными или
заряженными тушителями. Эти молекулы с трудом проникают внутрь гидрофобных
белков и тушат только остатки триптофана на поверхности белка.
[pic]
РИС. 9.1. Сопоставление динамического и статического тушения.

Важно знать, что линейность, наблюдаемая в координатах Штерна -
Фольмера, еще не доказывает, что происходит динамическое тушение
флуоресценции. В последующих разделах (разд. 9.3) будет показано, что
статическое тушение также дает прямую линию в координатах Штерна -
Фольмера. В общем случае различить статическое и динамическое тушение можно
по их зависимости от температуры и вязкости или, что более предпочтительно,
по измерению времени затухания флуоресценции.

9.2.1. Вывод уравнения Штерна - Фольмера
Уравнение Штерна - Фольмера может быть выведено несколькими способами.
Прежде всего рассмотрим интенсивность флуоресценции в отсутствие и в
присутствии тушителя. Интенсивность флуоресценции, наблюдаемая для
флуорофора, пропорциональна его концентрации в возбужденном состоянии F*.
При непрерывном облучении устанавливается стационарная концентрация
возбужденных флуорофоров и, следовательно, d[F*] /dt = 0. В отсутствие и в
присутствии тушителя дифференциальные уравнения, описывающие F*
представляются в виде
(9.2)
(9.3)
где f(t) - постоянная функция возбуждения флуоресценции, которая легко
исключается из этих уравнений. Г = ?0-1 представляет собой константу
скорости дезактивации флуорофора в отсутствие тушителя. Из уравнений (9.2)
и (9.3) получаем уравнение Штерна - Фольмера

(9.4)

Это уравнение может быть также выведено путем рассмотрения доли
возбужденных флуорофоров, дезактивирующихся путем излучения, по отношению к
общему числу возбужденных флуорофоров. Доля F0/F определяется отношением
скорости затухания Г флуоресценции к общей скорости затухания в присутствии
тушителя (Г+kq[Q]):

(9.5)

Это выражение также является уравнением Штерна - Фольмера. Так как
динамическое тушение - конкурирующий процесс, который дезактивирует
возбужденное состояние, время затухания в отсутствие (? 0) и в присутствии
(?) тушителя дается выражениями

(9.6), (9.7)
(9.8)

Последний вывод иллюстрирует важную характеристику динамического
тушения, которая состоит в одинаковом уменьшении интенсивности и времени
затухания флуоресценции (рис. 9.1):

(9.9)

Уменьшение времени затухания происходит из-за того, что тушение
представляет собой дополнительный конкурирующий процесс, дезактивирующий
возбужденное состояние без испускания флуоресценции, что ведет к уменьшению
квантового выхода. Благодаря этим ценным свойствам тушение при
столкновениях используют для контроля времени затухания с последующим
определением природы наносекундной кинетики затухания анизотропии (разд.
6.4) или временной зависимости релаксации растворителя (разд. 8.5).

9.2.2. Интерпретация бимолекупярной константы скорости тушения
Частота столкновений флуорофора с тушителем дается выражением

(9.10)

где k0 - диффузионно-контролируемая бимолекулярная константа скорости,
которая может быть вычислена по уравнению Смолуховского:

(9.11)

где R - радиус столкновения; D - сумма коэффициентов диффузии
флуорофора (Df) и тушителя (Dq); N - число Авогадро. Радиус столкновения
обычно принимается равным сумме молекулярных радиусов флуорофора (Rf) и
тушителя (Rq). Вывод этого выражения будет рассмотрен более подробно в
разд. 9.7. Уравнение описывает диффузионный поток молекул с коэффициентом
диффузии D через поверхность сферы радиуса R. Фактор 1000 необходим для
соблюдения размерности в тех случаях, когда концентрация выражена в молях
на литр: умножением на (N/1000) молярность пересчитывают в молекулы/см3.
Частота столкновений связана с бимолекулярной константой скорости
тушения через эффективность тушения ?:

(9.12)

Например, если ? = 0,5, то только 50% диффузионных столкновений
приводят к тушению и kq должно быть равно kо/2. Так как k0 определяется с
достаточной точностью, наблюдаемое значение kq может быть использовано для
оценки эффективности тушения. У тушителей, подобных кислороду и I-
эффективность обычно близка к единице, а у более легких галогенов меньше.
Эффективность тушения аминами зависит от восстановительного
потенциала флуорофора, флуоресценция которого должна быть потушена, что и
следует ожидать для реакций с переносом заряда. Эффективность тушения может
быть рассчитана на основе наблюдаемого значения k если известны
коэффициенты диффузии и молекулярные радиусы. Радиусы можно найти из
молекулярных моделей или молекулярных масс и плотностей исследуемых
веществ. Коэффициенты диффузии можно вычислить по уравнению Стокса -
Эйнштейна:

(9.13)

где k - константа Больцмана; ? - вязкость растворителя. Часто при
расчетах по уравнению Стокса - Эйнштейна недооцениваются коэффициенты
диффузии малых молекул. Например, для тушения кислородом флуорофоров,
растворенных в различных спиртах, было вычислено, что эффективность тушения
составляет 2 - 3 [26]. Столь невероятно большие значения были получены
потому, что коэффициент диффузии кислорода на самом деле в несколько раз
больше, чем предсказываемый уравнением (9.13). Это уравнение описывает
диффузию молекул, по размерам превышающих молекулы растворителя, поэтому
оно неприменимо для кислорода в этаноле. Коэффициенты диффузии можно также
получить из номограмм, основанных на термодинамических и физических
свойствах систем [27]. Одна такая номограмма показана на рис. 9.26. Если
коэффициенты диффузии известны, то бимолекулярную константу скорости
тушения для ? = 1 можно предсказать, используя уравнение Смолуховского
[(9.11)].
Поучительно обсудить типичные значения kq и концентрации тушителя,
необходимые для проявления заметного тушения. Рассмотрим тушение тринтофана
кислородом [28]. При 25њС коэффициент диффузии кислорода в воде составляет
2,5 . 10-5 см2/с, а триптофана - 0,66 . :10-5 см2/с. Если принять радиус
столкновения равным 5 ?, то подстановка в уравнение (9.11) дает k0 = 1,2 .
1010 М-1 . с-1. Наблюдаемое значение константы Штерна - Фольмера для
тушения кислородом составляет 32,5 М-1. Так как время затухания для
триптофана в отсутствие тушителя - 2,7 нc, то kq = 1,2 . 1010 М-1 . с-1,
что находится в прекрасном соответствии с предсказанным значением.
Следовательно, по существу, каждое столкновение кислорода с триптофаном
приводит к тушению, т.е. ? = 1. Бимолекулярная константа скорости тушения
порядка 1 . 1010 М-1 . с-1 может рассматриваться как наибольшее из
возможных значений для водных растворов. Несколько большее значение для
тушения кислородом (порядка 2 . 1010 М-1 . с-1) можно получить в
углеводородных растворителях [26]. В случае тушения другими веществами
ожидается меньший диффузионный предел для константы скорости тушения,
потому что коэффициенты диффузии этих тушителей меньше. Например,
эффективность тушения флуоресценции триптофана акриламидом также порядка
единицы, но kq = 5,9 . 109 М-1 . с-1 [5]. Это несколько меньшее значение
получается вследствие меньшего коэффициента диффузии акриламида по
сравнению с кислородом.

9.3. Теория статического тушения
В предыдущем разделе рассматривалось тушение, связанное с
диффузионными столкновениями между флуорофором и тушителем в течение
времени жизни возбужденного состояния, - процесс, зависящий от времени.
Тушение может также происходить в результате образования нефлуоресцирующего
комплекса в основном состоянии между флуорофором и тушителем. Как только
произошло поглощение света, комплекс немедленно возвращается в основное
состояние без испускания фотона (рис. 9.1).
Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя легко
вывести, используя константу ассоциации комплекса, записываемую следующим
образом:

(9.14)

где [F -Q] - концентрация комплекса; [F] - концентрация несвязанного
флуорофора. Если закомплексованная форма не флуоресцирует, то доля
оставшейся флуоресценции (F/F0) определяется той частью от общего
количества флуорофоров, которая не закомплексована (f), т.е. f =F/F0 .
Общая концентрация флуорофора [F] равна

(9.15)

Подстановка в (9.14) дает

(9.16)

Концентрации флуорофора можно заменить на интенсивности флуоресценции
и преобразовать выражение (9.16) к виду

(9.17)

Отметим, что зависимость F0/F от [Q] идентична зависимости, получаемой
для динамического тушения, за исключением того, что константа скорости
тушения здесь заменяется константой ассоциации. Данные по тушению
флуоресценции, полученные по измерению интенсивности в случае, если нет
дополнительной информации, можно объяснить либо динамическими, либо
статическими процессами. Для идентификации статического и динамического
тушения можно использовать времена затухания или зависимость тушения от
температуры или вязкости. Измерение времени затухания флуоресценции -
наиболее четкий метод для различения статического и динамического тушений.
Из-за статического тушения часть флуорофоров не наблюдается. Связанные в
комплекс флуорофоры не флуоресцируют, и наблюдается флуоресценция только
несвязанных флуорофоров. Не связанная в комплекс часть флуорофоров не
возмущена, и, следовательно, для нее время затухания равно ?. Таким
образом, для статического тушения ?0 / ? = 1 (рис. 9.1), в то время как для
динамического тушения F0/F = ?0/?.
СРАВНЕНИЕ СТАТИЧЕСКОГО И ДИНАМИЧЕСКОГО ТУШЕНИЯ. Отличие Статического
тушения от динамического часто может быть установлено не только измерением
времен затухания, но и путем рассмотрения других факторов. Динамическое
тушение зависит от диффузии. Поскольку повышение температуры приводит к
увеличению коэффициентов диффузии, можно ожидать, что бимолекулярная
константа скорости тушения возрастет с увеличением температуры (рис, 9.1).
Точнее, следует ожидать, что kq будет пропорциональна Т/?, так как
коэффициенты диффузии пропорциональны этому отношению [уравнение (9.1З)].
Напротив, при росте температуры скорее всего уменьшается стабильность
комплексов и тем самым значения констант статического тушения.
Еще одним дополнительным методом для отличия статического тушения от
динамического может служить тщательный анализ спектра поглощения
флуорофора. Динамическое тушение влияет только на возбужденные состояния
флуорофоров, и можно полагать, что оно не изменит спектры поглощения. В
противоположность этому образование комплекса в основном состоянии часто
приводит к возмущению спектра поглощения флуорофора.
9.4. Смешанное динамическое и статическое тушение

Во многих случаях флуорофор может быть потушен за счет как
столкновений, так и образования комплекса с тушителем. Характерная
особенность графика Штерна - Фольмера в таких случаях - отклонение вверх и
вогнутость по отношению к оси у (рис. 9.2). Остаточная флуоресценция (F/F0)
определяется произведением доли, не связанной в комплекс (f), и доли, не
потушенной диффузионными столкновениями.
[pic]
РИС. 9.2. Графические зависимости для смешанного динамического и
статического тушения флуорофоров одного вида.

Следовательно,

(9.18)

В предыдущем разделе было показано, что f-1 = 1 +КСТ [Q]. Инверсия
уравнения (9.18) и перестановка в правую часть последних членов дает

(9.19)

Эта модифицированная форма уравнения Штерна - Фольмера является
уравнением второго порядка относительно [Q], что объясняет изгиб графика
кверху, наблюдаемый, когда флуорофор одновременно тушится как по
статическому, так и по динамическому механизму.
Доля динамического тушения в наблюдаемом уменьшении флуоресценции
может быть определена по изменению времен затухания, т.е. по зависимости
?0/? = 1 + Кдин [Q]. Если таких данных нет, то уравнение (9.19) может быть
преобразовано для графического определения КСТ и Кдин , После перемножения
членов в скобках получится

(9.20) (9.21)
(9.22)

Кажущаяся константа скорости тушения Ккаж вычисляется для каждой
концентрации тушителя. График зависимости Ккаж от [Q] представляет собой
прямую линию с отсекаемым на оси у отрезком, равным КСТ + Кдин, и наклоном,
равным КСТКдин (рис. 9.2). Индивидуальные значения констант могут быть
получены из двух решений квадратного уравнения [уравнение (9.23)].
Динамическую составляющую обычно выбирают либо как решение, сравнимое по
величине с ожидаемым диффузионно-контролируемым значением, либо по
зависимости от температуры или вязкости, либо по другой имеющейся
информации.

9.5. Примеры статического и динамического тушения
Прежде чем перейти к другим теориям и примерам, связанным с тушением,
рассмотрим несколько примеров, которые иллюстрируют статическое и
динамическое тушение. Данные по тушению триптофана кислородом приведены на
рис. 9.3 [28]. График в координатах Штерна - Фольмера представляет собой
прямую, что указывает на проявление только одного механизма тушения.
[pic]
РИС. 9.3. Графическое представление тушения флуоресценции триптофана
кислородом, наблюдаемое по изменению времен затухания в возбужденном
состоянии и квантовых выходов флуоресценции.

Пропорциональное уменьшение времени затухания и квантового выхода
флуоресценции показывает, что наблюдаемый тип тушения обусловлен
диффузионным процессом. Из наклона графика Штерна - Фольмера можно
вычислить Кдин = 32,5 М-1, или что 50% флуоресценции тушится при
концентрации кислорода 0,031 М. Значений Кдин и времени затухания
флуоресценции достаточно для вычисления бимолекулярной константы скорости
тушения. Получаем kq = 1,2 . 1010 М-1 . с-1. Такое большое значение
указывает на эффективное тушение молекулярным кислородом.

На рис. 9.4 приведены данные по тушению N-ацетил-L-триптофанамида
акриламидом [5], который также эффективно тушит флуоресценцию триптофана.
В этом случае на графике Штерна - Фольмера виден существенный изгиб кривой
к оси у. В противоположность ожидаемому причиной отклонения графика Штерна
- Фольмера в положительную сторону не является образование комплекса.
Предполагается, что при высоких концентрациях тушителя часть флуорофоров
оказывается соседствующей с тушителем в момент возбуждения и, таким
образом, мгновенно дезактивируется. Этот эффект будет более подробно описан
в разд. 9.6. Доля динамического тушения акриламидом может быть вычислена
путем деления на переменную еv[Q], описывающую эффект близости, и, таким
образом, получают прямую в координатах Штерна - Фольмера.[pic]РИС. 9.4.
Графическое представление тушения N-ацетил-L-триптофанамида акриламидом в
55%-ном глицерине [5].
Измерение времен затухания подтвердило, что эта часть тушения имеет
динамическую природу. Бимолекулярные константы тушения, определенные в ряде
растворителей, приведены на рис. 9.5. Эти константы приблизительно линейно
зависят от T/?, что служит хорошим доказательством диффузионной природы
тушения акриламидом, Противоположные данные были получены по тушению N-трет-
бутилоксикарбонилтриптофана ионами ртути, как показано на рис. 9.6 [29].
Приблизительно 50% флуоресценции тушится при концентрации [Нg2+] = 20 . 10-
5 М, и, следовательно, константа тушения равна 5000 М-1. Если принять во
внимание время затухания флуоресценции N-mpem-бутилоксикарбонилтриптофана,
составляющее 8 нc, то кажущаяся бимолекулярная константа тушения окажется
равной 6,25 . 1011 М-1 . с-1. Полученное значение больше, чем это возможно
для диффузионно-контролируемой реакции, поэтому следует предположить
образование комплекса между Hg2+ и производным триптофана. Измерение времен
затухания флуоресценции подтверждает, что тушение имеет статическую
природу. Время затухания не меняется в присутствии ионов ртути (рис. 9.6).
В противоположность действию кислорода или акриламида тушение ионами ртути
происходит вследствие образования нефлуоресцирующего комплекса между Hg2+ и
N-трет-бутилоксикарбонилтриптофаном.

[pic]
РИС. 9.5. Зависимость тушения N-ацетил-L-триптофанамида акриламидом от
температуры и вязкости. 1 - водный раствор при различных температурах; 2 -
различные солевые растворы; 3- 55%-ный глицерин при различных температурах.

Тушение хлорида 10-метилакридиния (MAC) нуклеотидом гуанозин-5-
монофосфатом (GMP) дает прекрасный пример сочетания статического и
динамического тушения в приблизительно одинаковой степени [30]. График
Штерна - Фольмера приведен на рис. 9.7, и кривая для отношения F0/F имеет
явный изгиб кверху при высоких концентрациях GMP. Для этого случая есть
данные по временам затухания.
[pic]
РИС. 9.6. Графические зависимости для статического тушения N-тpeт-
бутипоксикарбонилтриптофана ионами ртути [29].
Константа динамического тушения была независимо определена из данных
по временам затухания, и Кдин была найдена равной 143 М-1. Используя
значение времени затухания в отсутствие тушителя (32,9 нс), можно
определить kq= 4,3 . 109 М-1 . с-1. Принимая во внимание большие размеры
молекул МАС и GMP, диффузионное тушение можно считать эффективным.






[pic]
РИС. 9.7. Зависимость тушения хлорида 10-метилакридиния гуанозин-5-
монофосфатом от концентрации СМР[30].
[pic]
РИС. 9.8. Графическое разделение динамической и статической констант
тушения MAC гуанозин-5'-монофосфатом [30].
Константы статического и динамического тушения могут быть определены
из графика зависимости Ккаж от концентрации GMP (рис. 9.8). Наклон S и
отсекаемый отрезок I составляют 9220 М-2 и 208 М-1 соответственно. Введя
обозначения I=Кдин+KСТ и S = Кдин KСТ, получим

(9.23)

Решение этого квадратного уравнения дает значения КСТ = 144 и 64 М-1.
Из данных по временам затухания известно, что Кдин =143 М-1, и,
следовательно константа статического тушения должна быть равна 64 М-1. При
концентрации GMP 0.016 М 50% MAC образует комплекс в основном состоянии и
не флуоресцирует. Следует отметить, что спектр поглощения MAC возмущен
гуанозин-5 -монофосфатом, как и должно быть при взаимодействии в основном
состоянии. Однако спектр возбуждения MAC не возмущен GMP. Это происходит
потому, что флуоресцируют только несвязанные флуорофоры, а поскольку они не
связаны, их спектр поглощения не возмущен.
9.7. Уравнение Смолуховского
Скорость диффузионно-контролируемой реакции, в которой лимитирующей
стадией является частота столкновений реагентов, дается выражением

(9.27)

где Di и Ri - коэффициенты диффузии и молекулярные радиусы
диффундирующих веществ; D и R - суммы этих величин. Одно вещество можно
рассматривать неподвижным, а второе - диффундирующим с коэффициентом
диффузии D. Это уравнение часто интуитивно объясняют как поток
диффундирующего вещества через поверхность сферы радиуса R, непосредственно
после чего следует тушение. Это описание вызывает некоторую путаницу, так
как диффузионный поток через поверхность пропорционален площади этой
поверхности и D. Площадь поверхности сферы равна 4?R2, но не 4?R, в то
время как в уравнении (9.27) содержится член 4?R, но не 4?R2. По-видимому,
более подходящее объяснение этого расхождения приведено ниже.
Если в растворе молекулы тушителя распределены неравномерно, то
возникает поток из более концентрированной в менее концентрированную
область раствора. Поток J (моль/с) равен

(9.28)

где А - площадь (см2); D - коэффициент диффузии (см2/с); dc/dx -
градиент концентраций [моль/см4 = моль/(см3 . см)].
Частота столкновений Z флуорофора с тушителем может быть приравнена
потоку тушителя через сферу радиуса R:
Z = площадь . D . градиент концентрации (9.29)


(9.30)

где (dc /dr)R - градиент концентрации на расстоянии R между
флуорофором и тушителем. По уравнению Смолуховского и, таким образом,

(9.31)

Величина (N[Q])/1000 - это число молекул в 1 см3, a R - расстояние.
Следовательно, эффективный градиент концентраций, вызывающий тушение при
столкновениях, определяется объемной концентрацией, деленной на R; это
эквивалентно тому, что в центре флуорофора не может быть тушителя.
Флуорофоры, которые соседствуют с тушителями, не флуоресцируют и не
наблюдаются; следовательно, уравнение (9.31) описывает эффективный градиент
вокруг непотушенных наблюдающихся флуорофоров. Исчезновение зависимости от
R2 в уравнении Смолуховского является результатом зависимости градиента
концентрации от R-1. Подробности приведены в работе [32].

9.8. Применение тушения в биохимии
Тушение флуоресценции Широко используется в биохимических
исследованиях. Применения многочисленны и разнообразны, и их практически
невозможно суммировать. Поэтому были отобраны результаты, которые наиболее
наглядно иллюстрируют информацию, получаемую из данных по тушению, а также
структурные особенности макромолекул, которые определяют диапазон тушения.

9.8.1. Влияние стерических факторов на тушение.
Комплекс DNA - этидийбромид
Планарный флуорофор этидийбромид (ЕВ) встраивается между парами
оснований двойной спирали DNA. Он может также связываться на внешней
стороне спирали, но такой тип связывания несуществен для данных,
приведенных на рис. 9.10. Тушение кислородом флуоресценции ЕВ было
использовано для того, чтобы установить, будут ли пары оснований DNA
предотвращать близкий подход молекулы кислорода к ЕВ. При связывании с DNA
время затухания флуоресценции ЕВ возрастает от 1,75 до 20,5 нc. Поэтому для
того, чтобы можно было вычислить бимолекулярные константы тушения, времена
затухания должны быть известны. На рис. 9.10 времена затухания нанесены на
ось х так, что наклон графика равен kq . В отсутствие DNA константа тушения
ЕВ составляет 0,346.1010 М-1 . с-1, что, по-видимому, в три раза меньше,
чем можно ожидать для диффузионно-контролируемой реакции тушения
кислородом. Такое уменьшение значения kq по сравнению с предсказываемым
(k0), по-видимому, является следствием строения ЕВ и присутствия объемистых
групп, окружающих ароматическую часть молекулы. Столкновения кислорода с
этими несопряженными частями молекулы не приводят к тушению. Такое явление,
наблюдаемое ранее для флуорофоров с объемистыми боковыми заместителями
[28], показывает, что необходимо проверять тушение любого флуорофора в
растворе перед проведением экспериментов, в которых используется флуорофор,
связанный с макромолекулой. На рис. 9.10 также приведены данные по тушению
ЕВ, встроенного между парами оснований двойной спирали DNA. В результате
такого встраивания бимолекулярная константа тушения уменьшается в 30 раз.
Это интерпретируют как результат стерического экранирования ЕВ,
обеспечиваемого за счет DNA. Пары оснований DNA прилегают к флуорофору с
обеих сторон и предотвращают столкновения с кислородом. В противоположность
этому белки [ 33] и мембраны [ 34] высокопроницаемы для молекулярного
кислорода. Уменьшение kq при связывании с DNA иллюстрирует эффект
стерического затруднения при тушении. Если макромолекула предотвращает
контакт между флуорофором и тушителем, то следует ожидать существенного
понижения значения kq .
[pic]
РИС. 9.10. Графическое представление тушения флуоресценции
этидийбромида в растворе и встроенного в двойную спираль DNA, (По данным
[28] с разрешения American Chemical Society.)

9.8.2. Влияние заряда на тушение флуоресценции
Сближению флуорофора и тушителя может препятствовать влияние заряда в
такой же степени, как и стерические факторы. Например, I-- отрицательно
заряженный тушитель, и можно ожидать, что он будет отталкиваться
отрицательными зарядами окружения флуорофора. Подобным образом I - должен
притягиваться к флуорофорам в положительно заряженном окружении. Притяжение
или отталкивание будет зависеть от ионной силы раствора: уменьшаться с ее
увеличением. В противоположность иодид-ионам нейтральные тушители, подобные
кислороду, не должны быть чувствительны к заряду окружения флуорофора.
Данные, иллюстрирующие влияние заряда на тушение, приведены на рис.
9.11 [28]. Были исследованы заряженные полиаминокислоты, каждая из которых
содержала небольшой процент триптофановых остатков в качестве флуорофора.
Один из сополимеров был получен на основе глутаминовой кислоты и,
следовательно, отрицательно заряжен при нейтральных значениях рН. Другой
сополимер - на основе лизина и, следовательно, при нейтральных рH заряжен
положительно. Было проведено тушение флуоресценции триитофана в этих
сополимерах и кислородом, и иодом. Зависимость тушения от заряда локального
окружения флуорофора неодинакова для О2 и I- из-за их различной
полярности. Тушение кислородом нечувствительно к заряду сополимера, как и
следует ожидать для незаряженного тушителя. Для обоих сополимеров
получена бимолекулярная константа тушения кислородом порядка 1-10'њ М-1 . с-
1 Напротив, тушение I- сильно зависит от заряда окружения триптофановых
остатков. Для полилизина скорость тушения иодид-ионами превышает допустимое
для диффузионно-контролируемой реакции значение, что указывает на
предпочтительную локализацию I вокруг положительно заряженного полимера.
[pic]
РИС. 9.11. Графическое представление тушения заряженных
попиаминокислот. содержащих триптофан, кислородом и иодид-ионом.
(По данным [28] С разрешения American Chemical Society.)
Для полиглутамата скорость тушения значительно ниже, чем можно было
ожидать для диффузионно-контролируемой реакции. Эти-результаты показывают,
что тушение любого флуорофора будет подвержено влиянию локального заряда,
который может увеличивать или уменьшать концентрацию тушителя в окружающем
пространстве.
9.8.3. Проникновение заряженных и нейтральных тушитепей в белки
Внутренние области белков обычно рассматриваются как неполярные.
Триптофановые остатки тоже неполярны. Можно ожидать, что по крайней мере
некоторые из этих остатков должны быть внутри белков и поэтому недоступны
для тушителей во внешней водной фазе. Это предположение проверяется путем
сравнения тушения кислородом и иодидом флуоресценции триптофана в
трипсиногене (рис. 9.12). Изоэлектрическая точка трипсиногена 9,3, и, таким
образом, он заряжен положительно при рН 3, при котором проводились
эксперименты. Исходя из влияния заряда на тушение, как это наблюдалось для
сополимеров аминокислот (разд. 9.8.2), следовало ожидать увеличения тушения
иодидом. Тем не менее, наблюдается значительно более сильное тушение
кислородом, чем иодидом. Константа тушения для кислорода составляет ~ 40%
от ожидаемой для диффузионно-контролируемой реакции. Подобные результаты
были получены для большого числа белков [33, 34]. Быстрая диффузия
кислорода внутри белков интерпретируется как результат высокой динамической
подвижности матрицы белка, которая флуктуирует в наносекундном временном
диапазоне таким образом, что обеспечивает свободную диффузию кислорода. В
противоположность этому для иодида наблюдается слабое тушение. Отсутствие в
данном случае значительного тушения объясняется тем, что заряженные и
гидратированные иодид-ионы не могут проникать внутрь неполярного ядра
белка. Следовательно, путем сравнения тушения заряженными и незаряженными
молекулами можно выявлять относительную проницаемость макромолекулы для
этих веществ.
Методические подробности, приведенные в подписи к рис. 9.12,
иллюстрируют некоторые важные соображения для любых экспериментов по
тушению. Длины волн возбуждения, выбранные для тушения кислородом и
иодидом, составляют 280 и 290 нм соответственно.
[pic]
РИС. 9.12. Зависимость тушения флуоресценции трипсиногена от
концентрации кислорода или иодид-иона.
Тушение 02: 0,001 М НСl, возбуждение при 280 нм; тушениеI-: 0,001 М
НСl, возбуждение при 290 нм; [KCl] + [KI ] = 0,5 М; 10мМ Na2s203.
Флуоресценцию регистрировали при 334 нм для обоих образцов.

Большая длина волны возбуждения для тушения иодидом обусловлена тем,
что I- поглощает свет при 280 нм. Из-за этого может возникнуть эффект
внутреннего фильтра, который приведет к кажущемуся уменьшению интенсивности
флуоресценции и, таким образом, исказит данные по тушению. Независимо от
того, какой тушитель используется, важно убедиться в отсутствии эффекта
внутреннего фильтра. Если такой эффект имеет место, наблюдаемая
интенсивность флуоресценции должна быть откорректирована. Следует отметить,
что на измерение времен затухания флуоресценции, как правило, не влияют
эффекты внутреннего фильтра, так как оно практически не зависит от общей
интенсивности. .
В подписи к рис. 9.12 для опытов по тушению иодидом отмечено
использование КС1 и Na 2S2O3. Хлорид калия применяется для поддержания
постоянного значения ионной силы при изменении концентрации иодида в
растворе, а Na2S203 необходим для поддержания иодида в восстановленном
состоянии. В противном случае возможно образование реакционноспособного I2
, который может проникать в неполярные области белков и мембран.
9.8.4. Опредепение поверхностной доступности триптофановых остатков в
бепках по тушению флуоресценции иодид-ионами.
В предыдущем разделе отмечалось, что степень тушения флуоресценции
триптофана иодидом меньше, чем степень тушения кислородом в эквивалентной
концентрации. Такое различие интерпретировалось как результат
неспособности иодид-ионов проникать во внутренние области белка. Это
наводит на мысль, что тушение I2- или другими соединениями, не проникающими
в белки, можно было бы использовать для определения той части общей
интенсивности флуоресценции, которая связана с поверхностно-локализованными
остатками. Хотя это и не видно из рис. 9.12, тушение флуоресценции
триптофана иодидом обычно характеризуется изгибом графика Штерна - Фольмера
вниз к оси х (рис. 9.13). При высоких концентрациях тушителя практически
все доступные остатки потушены. Остаточная флуоресценция связана с
недоступными для тушения остатками, поскольку их флуоресценция не зависит
от концентрации тушителя.
Тушение двух типов флуорофоров, один из которых недоступен для
тушителя, можно проанализировать, используя модифицированную форму
уравнения Штерна - Фольмера [7]. Примем, что существуют два типа остатков
триптофана, один из которых доступен (1) для тушения, а другой - недоступен
(2) или "спрятан". Общая флуоресценция в отсутствие тушителя F0
определяется
выражением
[pic] (9.32)
где индексом 0 обозначена интенсивность флуоресценции в отсутствие
тушителя. В присутствии тушителя интенсивность доступной фракции /
уменьшается в соответствии с уравнением Штерна - Фольмера, в то время как
"скрытая" фракция не тушится.
[pic]
[Q] 1/[Q]
РИС. 9.13. Графики Штерна - Фольмера (а) и модифицированного уравнения
Штерна - Фольмера (б) для двух типов флуорофоров. один из которых
недоступен для тушителя.

Следовательно,
[pic] (9.33)
где К - штерн-фольмеровская константа тушения доступной для тушения
фракции; [Q] - концентрация тушителя. Вычитание уравнения (9.33) из (9.32)
дает
[pic] (9.34)
Обращением уравнения (9.34) с последующим делением на уравнение (9.32)
получаем
[pic] (9.35)
где f1 - доля начальной флуоресценции, доступная для тушения:
(9.36)

Эта модифицированная форма уравнения Штерна - Фольмера позволяет
определить графически f1 и К. На графике зависимости F0 /?F от 1/(Q]
значение
f1 определяется по отсекаемому отрезку, a (f1K)-1 - по наклону.
Отсекаемый отрезок отражает экстраполяцию к бесконечно большой концентрации
тушителя (1/[Q] = 0). Значение F0 /(F0 -F) при данной концентрации тушителя
соответствует обратной величине потушенной флуоресценции. При этой
концентрации только недоступные остатки будут флуоресцировать.
Пример разделения остатков триптофана на внутренние и внешние дает
тушение лизоцима иодид-ионами [ 7]. На рис. 9.14 приведены графики Штерна
-Фольмера для тушения триптофана ионами I- в отсутствие и в присутствии 6 М
гуанидингидрохлорида. Это вещество денатурирует белок. Изгиб кривой вниз в
отсутствие денатурата указывает на наличие недоступной для тушения фракции
флуорофоров. Пересчет этих данных по модифицированному уравнению Штерна -
Фольмера (9,35) дает приблизительно прямую линию, Отсекаемый отрезок на оси
у f-1) равен 1,5 (рис. 9.14, б), следовательно, 66% общей флуоресценции
нативного белка доступно для тушения. В противоположность натив-ному белку
в присутствии 6 М гуанидингидрохлорида наблюдается прямолинейная
зависимость в координатах Штерна - Фольмера (рис;. 9.14, а). Использование
модифицированного уравнения Штерна - Фольмера в этом случае не дает
дополнительной информации, за исключением подтверждения того, что в
денатурированном белке f 1 =1, т.е, все триптофановые остатки стали
доступны для иодид-ионов.
Тушение поверхностно-доступных остатков триитофана в принципе
позволяет различить спектры испускания внутренних и внешних остатков.
Относительно селективного тушения поверхностных остатков триптофана иодидом
мы считаем, что остаточная флуоресценция исходит от "скрытых" триптофановых
остатков, и следует ожидать, что их флуоресценция должна быть сдвинута в
коротковолновую область по сравнению с потушенными остатками. Последние,
как полагают, должны находиться на поверхности белка, и, следовательно, их
спектр флуоресценции должен быть сдвинут в длинноволновую область.
[pic]
РИС. 9.14. а- график Штерна - Фольмера для тушения лизоцима иодид-
ионами в присутствии (7) и в отсутствие (2) гуанидингидрохлорида.
б - график в модифицированных координатах Штерна - Фольмера. (С
разрешения авторов работы [7] и American Chemical Society.)

На рис. 9.15 приведены спектры испускания нативного и
денатурированного лизоцима в присутствии и в отсутствие 0,2 М KI. В
результате тушения спектр испускания нативного белка сдвигается в
коротковолновую область. Это происходит потому, что незатушенная
флуоресценция обусловлена остатками, "скрытыми" внутри белка. Приведен
также дифференциальный спектр (кривая 3), полученный по разности между
незатушенным и потушенным спектрами испускания и соответствующий спектру
испускания потушенных остатков. Как и предполагалось, флуоресценция этих
остатков сдвинута в длинноволновую область по сравнению с полным спектром
испускания, Такой спектральный сдвиг, наблюдающийся при тушении, доказывает
селективное тушение определенной группы флуорофоров. Дифференциальный
спектр показывает, что максимум испускания потушенных остатков имеет
значение ~350 нм - типичное для триптофановых остатков, экспонированных в
воду. Существенно, что при тушении денатурированного белка не наблюдается
спектральных сдвигов (рис. 9.15, б). Этого и следовало ожидать, так как все
триптофановые остатки экспонированы в растворитель и, следовательно, имеют
одинаковые спектры испускания.
[pic]
РИС. 9.15. Спектры флуоресценции нативного (а) и денатурированного (б)
лизоцима.
1 - в отсутствие тушителя 0,2 М KI; 2 - в присутствии тушителя; 3 -
дифференциальный спектр, соответствующий флуоресценции потушенных остатков
триптофана; 4 - фон. Денатурация вызывается 6 М гуанидингидрохлоридом.
[pic]
РИС. 9.16. Графики в модифицированных координатах Штерна - Фольмера
для тушения пепсина кислородом и иодид-ионами [33].
Различное тушение флуоресценции белков полярными и неполярными
тушителями выявляется при сравнении тушения пепсина кислородом и иодидом
[33]. В этом случае использовалось модифицированное уравнение Штерна
-Фольмера (рис. 9.16). Пепсин содержит шесть триптофановых остатков. Для
кислорода отсекаемый отрезок на оси у равен 1 (рис. 9.16, 6).
Следовательно, все шесть остатков одинаково доступны для тушения
кислородом. Принимая, что по крайней мере один остаток находится внутри
белка, можно полагать, что пепсин проницаем для кислорода. Напротив, для
тушения иодидом отсекаемый отрезок на оси у соответствует доступности
только 85% флуоресцирующих остатков (рис. 9.16, а). Этот результат, по-
видимому, указывает на то, что по крайней мере один из шести остатков
находится внутри белка, в области, непроницаемой для I-.
При разделении общей флуоресценции на доступную и недоступную фракции
необходимо иметь в виду, что может существовать не два класса триптофановых
остатков, а больше. Даже предполагаемая "недоступная" фракция может быть
частично доступной для тушения. Приведенный выше способ обеспечивает
полезное, но произвольное разделение на два условных класса триптофановых
остатков.
9.8.3. Установпение поверхностной доступности мембранна-связанных
белков произвоцными пиколиния
В качестве последнего примера использования модифицированной формы
уравнения Штерна - Фольмера приведены данные по тушению флуоресценции
триптофана мембран саркоплазматического ретикулума перхлоратом N-метил-4-
пиколиния [ 25].
[pic]
РИС. 9.17. График в модифицированных координатах Штерна - Фопьмера для
флуоресценции триптофана в мембранах саркоплазматического ретикулума,
иллюстрирующий частичную доступность мембранно-связанной Са 2+- АТРазы для
тушений [25].
1 - в буферном растворе; 2 - для мембран, разрушенных трифторэтанолом.

Основным белком этих мембран является Са 2+ -АТРаза. N-Метил-4-
пиколиний тушит флуоресценцию триптофана динамическим путем, по-видимому,
по механизму переноса заряда. Катион тушителя хорошо растворим в воде, и
предполагается, что это соединение будет тушить триптофа-новые остатки
только на поверхности мембран. График в модифицированных координатах Штерна
- Фольмера приведен на рис. 9.17. По отрезку, отсекаемому на оси у, доля
доступных остатков оценивается как ~ 0,54. Разрушение мембран
трифторэтанолом приводит к увеличению доступности триптофановых остатков
для тушителя, растворенного в воде (f1 = 0,81). В последующей работе [
25] авторы использовали другие тушители, которые локализуются на границе
раздела липид - вода и тушат триптофановые остатки в этой специфической
локализации. Используемые тушители представляли собой гидрофобные
производные 4-метилпиколиния, такие, как М-гексил-4-пиколиний. Путем подоб'
ных исследований можно получить описание структурных особенностей мембранно-
связанных белков с малым разрешением.
9.8.6. Применение тушения дпя выявления локализации
мембранно-связанных фпуорофоров
Флуоресцентные зонды широко используют для исследования структурных и
динамических свойств мембран. Интерпретация полученных данных облегчается
знанием локализации флуорофора но отношению к поверхности раздела липид -
вода; Так как тушение зависит от молекулярного контакта между флуорофором и
тушителем, локализация флуорофора может быть установлена, если тушение
флуоресценции проводится тушителями с известной локализацией.
Антроилоксижирные кислоты [35] широко используются в качестве мембранных
зондов отчасти из-за того, что доступен ряд производных, в которых
антроилокси-группа расположена в различных положениях вдоль цепи жирной
кислоты. Структура этих производных приведена на рис, 9.18. Ясно, что
антроилокси-групна молекул должна тем глубже располагаться в мембране, чем
дальше от карбоксильной группы находится место антроилокси-заместителя в
жирной кислоте.

[pic]
РИС. 9.18. Структура н-9-антроилоксижирных кислот.
Локализация этих зондов изучалась по тушению Сu2+ (рис, 9.19, а).
Кажущиеся константы тушения значительно больше, чем можно ожидать для диффу-
зионно-контролируемых реакций, что является следствием связывания Сu2+ с
липидами, главным образом на поверхности раздела липид - вода. Время
затухания флуоресценции этих зондов в отсутствие тушителя ~ 10 нc.
Эффективность тушения уменьшается в ряду: 2-АР > 6-AS > 9-AS > 12-AS > M-9-
A. Полученные результаты показывают, что антроилокси-заместители
отодвигаются от поверхности раздела липид - вода в той же степени, как это
можно предсказать, исходя из их структуры. M-9-A не является производным
жирной кислоты, но, по-видимому, его незаряженная молекула расположена в
центре бислоя и максимально удалена от поверхности раздела липид - вода.

[pic]
РИС. 9.19. Графики для выявления локализации мембранно-связанных
флуоро- .-форов при помощи полярного тушителя Cu2+ (а) и неполярного
тушителя диметилани- . лина (б) [ 35].

Локализация этих зондов была также определена при использовании липид-
растворимого тушителя диметиланилина (рис. 9.19, б). Были получены
аналогичные, но не полностью совпадающие результаты. Те флуорофоры,
которые, как предполагается, наиболее глубоко проникают в мембрану (М-9-А,
12-AS), тушатся в наибольшей степени липид-растворимым тушителем, и снова
кажущиеся бимолекулярные константы тушения больше, чем это возможно для
диффузионно-контролируемой реакции. Расхождение связано с тем, что на оси
концентраций (рис. 9.19, б) приведены общие концентрации диметиланилина.
Это неполярное соединение концентрируется в мембранах, что приводит к
увеличению концентрации тушителя в окружении флуорофора. В разд. 9.8.8.1
будут описаны методы анализа таких данных с помощью коэффициентов
распределения тушащих веществ между липидом и водой. Несмотря на это
усложнение, приведенные результаты иллюстрируют возможность получения
информации о мембранно-связанных флуорофорах по тушению флуоресценции.
9.8.7. Тушение мембранно-связанных фпуорофоров кислородом
Прежде чем детально обсуждать, как влияют распределения между водой и
липидом на тушение, полезно рассмотреть тушение, вызываемое слабо
распределяющимся тушителем - кислородом. Тушение кислородом 2-метилантра
-цена - неполярного соединения, концентрирующегося в мембранах в области
ацильных заместителей, в везикулах димиристоил- и динальмитоилфосфати-
дилхолина, приведено на рис. 9.20. В условиях эксперимента (31 њС) везикулы
DMPC находятся выше температуры фазового перехода (Тc = 24њC), а везикулы
DPPC - ниже их Т (37њС).
[pic]
РИС. 9.20. Графическое представление тушения 2-метилантрацена
кислородом в липидных бислоях.
(С разрешения автора работы [45] и Elsevier Biomedical Press.)

В соответствии с оценками, полученны-, ми из стационарной анизотропии
DPH (см. рис. 5.12), микровязкость DMPC и DPPC составляет 0,98 - 8,2 П
соответственно. Однако фазовое состояние бислоев оказывает только
двукратное влияние на тушение кислородом (рис. 9.20). Более того, константы
тушения заметно больше, чем предсказываемые на основании уравнения Стокса и
Эйнштейна [ уравнение (9.13)]. Для вязкости порядка 4 П по этому уравнению
и уравнению Смолуховского [(9.11)] получается диффузионно-контролируемая
константа 0,00025 . :1010 М-1 . с-1 в отличие от наблюдаемого значения 0,3
. ;1010 М-1 . с-1. Эти результаты показывают, что любые значения
микровязкости зависят от особенностей молекулярных движений в процессах,
которые использованы для определения микровязкости. В подобных случаях
малые молекулы кислорода могут диффундировать быстрее, чем это оценивается
на основании данных по вращательной диффузии больших молекул DPH.
Точная интерпретация приведенных на рис. 9.20 констант бимолекулярного
тушения кислородом ограничена отсутствием сведений о растворимости тушителя
в мембране. Эффективные концентрации тушителя, приведенные на рисунке, были
вычислены в предположении, что коэффициент распределения кислорода между
водой и липидом составляет 6,48 и что это значение не зависит от фазового
состояния бислоев. Интересно рассчитать проницаемость липидных мембран для
молекулярного кислорода с учетом этих предположений. Проницаемость Р бислоя
может быть аппроксимирована выражением
Р = КD/?х (9.47)
где D - коэффициент диффузии; К - коэффициент распределения; ?х -
толщина мембраны. Бимолекулярные константы тушения 2-МА составляют 1 /5
диффузионно-контролируемого значения. Так как коэффициент распределения
между липидом и водой также ~ 5, то но уравнению (9.37) получается, что
липидные бислои в той же степени проницаемы для кислорода, как и слой воды
эквивалентной толщины [34]. Следовательно, эти биологические структуры не
затрудняют диффузионного транспорта кислорода.
9.8.8. Метод определения диффузии и коэффициентов распределения
тушителей по тушению мембранно-связанных фпуорофоров
Диффузионное тушение мембранно-связанных флуорофоров очень полезно при
исследовании диффузий и распределения малых молекул в мембранах.
Достоинства метода состоят в следующем:
1. Целый ряд молекул, представляющих биологический интерес, могут
служить диффузионными тушителями. Например, ароматические амины, многие из
которых являются местными анестетиками, тушат флуоресценцию антроильных
производных жирных кислот. Карбазол и его алкильные производные тушатся
многочисленными хлорированными углеводородами [ 18]и нейротоксином -
хлоридом метилртути [ 17]. Другие примеры описаны в разд. 9.1. Благодаря
такому разнообразию исследователи не ограничены специальными случаями,
например, образованием эксимеров пирена.
2. Благодаря областям локальной неупорядоченности, создаваемым
флуорофорами, наблюдаемые спектральные параметры могут в первую очередь
отражать возмущенную область бислоя. Тушение происходит после диффузии
тушителя на расстояние 10 - 1000 е, т.е. через невозмущенную область
бислоя.
3. Константы динамического тушения отражают частоту столкновений между
зондом и тушителем. Так как эта частота пропорциональна локальной
концентрации тушителя, то можно получить информацию и о скорости тушения, и
о коэффициенте распределения тушителей между липидом и водой.
При интерпретации данных по тушению, получаемых для мембранно-
связанных флуорофоров, возникает проблема, с которой не сталкиваются в
гомогенных растворах. В общем случае концентрация малых гидрофобных молекул
в мембране и водной фазе неизвестна. Для гидрофобных тушителей и мембранно-
связанных флуорофоров при интерпретации данных по тушению необходимо
отличать скорость диффузии тушителя от эффекта его распределения между
липидом и водой. К счастью, это возможно. Более того, тушение позволяет
найти коэффициент распределения между липидом и водой.
9.8.8.1. Тушение при столкновениях тушителем, предпочтительно
распределенным в одной из фаз
Рассмотрим тушитель, распределенный между мембраной и водной фазой., В
ненасыщенных растворах тушителя его концентрации в водной (вод) и
мембранной (м) фазах связаны коэффициентом распределения:
[pic] (9.38)
Общая концентрация добавленного тушителя [ Q ]общ
распределяется между водной и мембранной фазами в соответствии с уравнением
[pic] (9.39)

где V - объемы различных фаз.
Введя понятие объемной доли мембранной фазы получаем для мембранной
концентрации тушителя
[pic](9.41.)
Подстановка этого выражения в уравнение Штерна - Фольмера дает
[pic] (9.42)
где kм - бимолекулярная константа тушения для мембранно-связанного
флуорофора. Кажущаяся константа тушения представляется в следующем виде:
[pic] (9.43)
Когда флуорофор находится в мембранной фазе, кажущаяся константа
тушения зависит от Р, ам и kм . График зависимости k-1 каж от am позволяет
определить Р и kм. Таким образом, с помощью метода тушения одновременно
определяются и степень, с которой тушитель распределяется в бислое, и
скорость его диффузии в этом бислое.
Приведенный выше метод определения коэффициента распределения вода -
липид применяется только тогда, когда тушение происходит за счет
столкновений с молекулами тушителя, присутствующими в бислое в момент
возбуждения. Если в таких столкновениях участвуют и молекулы тушителя,
находившиеся в водной фазе, которые диффундируют в лииидную фазу в течение
времени пребывания в возбужденном состоянии, то кажущееся тушение не должно
зависеть от концентрации липида. Эта ситуация, когда тушение происходит как
в водной, так и в липидной фазах, является более сложной.
9.8.8.2. Распределение неполярного тушителя между водой и везикулами
DMPC
На примере тушения меченного карбазолом фосфолипида в везикулах DMPC ?-
гексахлорциклогексаном (линданом) [36] можно показать применимость
уравнения (9.43). В этом случае тушение было определено по измерению
времен затухания, что гарантировало наблюдение только динамического
тушения. Большее тушение было обнаружено при низких концентрациях липида
(рис. 9.21), когда добавление того же общего количества линдана приводит к
его более высокой концентрации в мембране. Это происходит вследствие малого
количества липида, в котором может растворяться тушитель в соответствии с
коэффициентом распределения. Именно такая зависимость кажущейся константы
тушения от концентрации липида позволяет найти коэффициенты распределения.
[pic]
РИС. 9.21. Зависимость времени затухания флуоресценции |3-11-(9-
карбазол)унде-каноилфосфатидипхолина, связанного с везикулами DMPC в
присутствии линдана, от концентрации пиндана.(С разрешения авторов работы
[З6] и Elsevier Biomedical Press.)
[pic]
РИС. 9.22. Графическое определение коэффициентов диффузии и
распределения линдана в везикулах DMPC.

Для этого строят график зависимости kкаж от [Q]общ (рис. 9.22). Так
как коэффициент распределения велик, то наклон приблизительно равен kм-1.
Отсекаемый отрезок составляет ~(kмP)-1 Из этих данных можно легко
вычислить, что линдан распределяется в везикул ах DMPC с коэффициентом
9500.
Для успешного применения описанной методики необходимо, чтобы диапазон
концентраций липида укладывался в диапазон частичного распределения
добавленного тушителя. Доля тушителя, связанного с мембраной (fм), дается
выражением,

9.44


Для случая, представленного на рис. 9.22, fм изменяется от 0,49 до 0,98.
Если коэффициенты распределения превышают 10 , необходимы более раз
бавленные суспензии мембран.
9.8.9. Влияние вязкости на эффективность тушения
В некоторых случаях, например для мембранно-связанных флуорофоров и
тушителей, желательно использовать наблюдаемые бимолекулярные константы
тушения для вычисления коэффициента диффузии тушителя. Для этого должна
быть известна эффективность тушения ? и необходимо, чтобы эта эффективность
была одинакова во всех исследуемых образцах. Так, эффективность тушения для
конкретной комбинации флуорофор - тушитель можно вычислить из экспериментов
в растворах с известной вязкостью. Затем тушение этого же флуорофора может
быть изучено, когда он связан с мембраной или белком. Иногда изменение
вязкости может приводить к изменению эффективности тушения. Зависимость ?
от вязкости можно пояснить следующим образом. Рассмотрим схему реакции
(F - Q)* _ возбужденный комплекс флуорофора и тушителя, который
еще не дезактивировался. Для реакций в возбужденном состоянии, таких, как
образование эксиплекса с амином, (F -Q)* может быть эксиплексом. Однако мы
будем рассматривать только случай, когда (F -Q)* не флуоресцирует. Если (F
-Q)* флуоресцирует, необходимо более сложное выражение. При k2 » k1 тушение
очень эффективно и константа тушения определяется k0 [ уравнение (9.11) ].
Однако для менее эффективных тушителей k1 может быть сравнима с k2, тогда
константа тушения равна
(9.45)

Следовательно, у = k2/(k1 + k2) - доля столкновений, приводящих к
тушению. Из сказанного ясно, что увеличение вязкости может повышать
эффективность тушения слабыми тушителями, так как оно замедляет разобщение
флуорофора и тушителя. Увеличение продолжительности каждого диффузионного
столкновения приводит к повышению вероятности тушения за время
столкновения.
Мы отмечали, что это простой случай. Кажущаяся бимолекулярная
константа тушения может быть сложной и зависеть от концентрации тушителя,
вязкости и спектральных свойств комплекса, образующегося при столкновении.
Дополнительное обсуждение этого вопроса проведено в работах [21, 37 - 40].
При благоприятных обстоятельствах такие усложнения могут быть исключены
путем использования эффективных тушителей.
9.8.10. Обмен цитохромом b5 между мембранами
Цитохром b5 (cyt b5 ) - интегральный мембранный белок, который состоит
из двух различных доменов. Гидрофобный "хвост", включающий приблизительно
50 аминокислотных остатков, ответствен за связывание cyt b5 с
мембранами. Второй домен (гидрофильный) содержит гемовую область, которая
находится, по-видимому, на поверхности мембраны. Обычно гемовые белки
флуоресцируют слабо или не флуоресцируют совсем из-за переноса энергии с
триптофановых остатков на нефлуоресцирующий гем. В cyt b5 расстояние между
гемом и триптофановыми остатками гидрофобного "хвоста" достаточно большое
для того, чтобы появилась заметная флуоресценция этих остатков. Фактически
триптофановые остатки гидрофобного "хвоста" 'являются главной причиной
флуоресценции этого белка. Триптофановая флуоресценция из гем-содержащей
области cyt b5 не наблюдается. В cyt b5 из печени теленка флуоресцирует
главным образом один из трех триптофановых остатков, расположенных в
гидрофобном "хвосте". Этот остаток находится на 21 А ниже поверхности
раздела липид - вода, недалеко от центра бислоя [ 41 ].
Тот факт, что этот остаток обусловливает флуоресценцию cyt b5
позволяет разработать простой метод измерения кинетики обмена cyt b5 из
печени теленка между везикулами [42].
[pic]
РИС. 9.23. Спектр флуоресценции цитохрома b5 [43].
Приведены спектры в буферном растворе в присутствии 0,5 мМ РОРС и 0,5
мМ ВгРС, а также контрольные спектры РОРС и ВгРС. (С разрешения American
Chemical Society.)

Был синтезирован бромсодержащий фосфо-липид-1,2-бис(9,10-
дибромстеароил)-(С4)-глицерин-3-фосфорилхолин* (ВгРС). При связывании cyt
b5 с везикулой, состоящей из этого липида, флуоресценция триптофана из
области "хвоста" тушится (рис. 9.23). Напротив, связывание cyt b5 с
небромированным липидом приводит к усилению флуоресценции белка. Было
найдено, что относительная флуоресценция cyt b5 прямо пропорциональна
доле cyt b5 связанного либо с пальмитоилолеоилфосфатидилхолином, либо с
ВгРС (рис. 9.24). При смешивании связанного с РОРС cyt b5 с везикулами Вг
PC наблюдается зависимое от времени уменьшение флуоресценции. Напротив, при
смешивании cyt b5 связанного с ВгРС, с везикулами РОРС наблюдается
постепенное возрастание флуоресценции со временем. Эти зависящие от времени
изменения происходят вследствие обмена cyt b5 между везикулами (рис.
9.25). Полученные результаты, а также данные по линейной зависимости
флуоресценции cyt b5 от его доли в каждом типе везикул были использованы
для вычисления скорости обмена cyt bs между этими везикулами. Из серии
таких измерений был сделан вывод, что cyt b5 обменивается между
везикулами через водную фазу и что прямой контакт везикул для обмена не
нужен. Этот пример показывает, как селективное тушение может быть
использовано для того, чтобы различить, в каком из двух окружений находится
белок, и, таким образом, позволяет легко изучить количественно кинетику
обмена. Поскольку имеется большое число возможных пар флуорофор - тушитель,
подобная методика может быть применима и в других случаях.
[pic]
РИС. 9.24. Зависимость относительной флуоресценции цитохрома b5 в
смеси мицелл РОРС и ВгРС от доли РОРС [42].

[pic]
РИС. 9.25. Графическое представление кинетики обмена цитохрома b5
между везикулами РОРС и ВгРС [42].
Fнабл - флуоресценция, наблюдаемая в ходе реакции; F0 - флуоресценция
в нулевой момент времени после добавления второго типа везикул; FpaBH -
флуоресценция в равновесии, наблюдаемом через 7 ч.
1 - донорные везикулы ВгРС, акцепторные - РОРС; 2 - донорные везикулы
РОРС, акцепторные - ВгРС. По-разному обозначены точки, относящиеся к разным
концентрациям везикул и цитохрома b5