Программа спецкурса по технике работы с нуклеиновыми кислотами (генетическая инженерия)

Лектор - А.А. Колесников

Введение. Особенности экспериментальной работы с биологическим материалом. Правила техники безопасности.

1. Методы выделения ДНК.
• Выделение ДНК из прокариотических организмов.
• Выделение суммарной ДНК из клеток животных.
• Выделение ДНК из насекомых.
• Выделение суммарной ДНК из растительных клеток.
• Особенности выделения ДНК из грибов.
• Выделение митохондриальной ДНК (через выделение митохондрий, щелочной вариант, через градиент CsCl).
• Выделение плазмидной ДНК (два варианта - щелочной и температурный).
• Выделение фаговых ДНК.
• Выделение ДНК с использованием коммерческих наборов.


2. Методы анализа ДНК.
• Методы количественного определения НК.
• Определение нуклеотидного состава. (Хроматография, центрифугирование в градиенте плотности CsCl, по кривой плавления).
• Определение кинетики реассоциации.
• Электрофорез ДНК в агарозном геле.
• Электрофорез НК в полиакриламидном геле (ПААГ) (в денатурирующих и нативных условиях).
• Методы разделения одно- и двуцепочечных молекул.


3. Методы работы с РНК. Особенности работы с РНК. Ингибиторы нуклеаз.
• Выделение суммарной РНК.
• Выделение рибосомной РНК.
• Выделение РНК из субклеточных структур.
• Выделение НК из геля.
• Выделение суммарной тРНК из дрожжей.


4. Определение первичной структуры НК.
• Метод химического расщепления по Максаму-Гилберту.
• Ферментативный метод Сэнгера для случая плазмид.
• Метод ПЦР-секвенирования.
• Автоматическое секвенирование.


5. Гибридизация ДНК:ДНК и ДНК:РНК.


6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
• Собственно метод ПЦР.
• Различные варианты ПЦР, включая: ПЦР с колоний, ПЦР с мазков, :
• Получение кДНК копии с РНК (RT-ПЦР).
• Определение концевых последовательностей нуклеотидов в РНК (RACE).


7. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.


8. Методы получения рекомбинантных плазмид (через "липкие" концы, через "тупые" концы). Типы векторов. Особенности клонирования ПЦР продуктов. Различные методы трансформации бактериальных клеток. Трансформация эукариотических клеток. Техника работы с экспрессионными векторами.


9. Методы мечения 5' и 3' концов НК.


10. Методы компьютерной обработки результатов.

Рекомендуемая литература

1. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ./ Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. - М.: Мир, 1984. - 480 с.
2. Sambrook J., Russel D.W. (2001) Molecular Cloning, Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
3. Методы молекулярной генетики и генной инженерии / Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С. и др. - Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990. - 248 с.
4. Анализ генома. Методы. Пер. с англ./ Под ред. К. Дейвиса - М. Мир, 1990. - 247 с.
5. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: Пер. с англ./ Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. - М.: Мир, 1991. - 408 с.
6. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Пер. с англ./ Под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги. - М.:Мир,1999. - 558 с.

версия для печати
Страница последний раз обновлялась 18.02.2009