Программа спецкурса 'Транспорт веществ через биологические мембраны в норме и патологии'
Лекторы - А. М. Рубцов и О. Д. Лопина
Особенности строения клеток прокариот и представителей разных царств эукариот. Фософолипиды, сфинголипиды, цереброзиды, ганглиозиды: структура и физико-химические свойства. Фосфолипидные мицеллы, липосомы и бислои. Биологические мембраны. Асимметрия мембран. Липидные кластеры. Подвижность липидов в мембранах, холестерин. Латеральная диффузия липидов. Фософолипазы, десатуразы и другие ферменты, участвующие в изменении свойств мембран.
Мембранные белки: трансмембранные домены на основе альфа-спиралей и бета-складок. Способы заякоривания периферических белков в мембранах. Атомно-силовая микроскопия и радиоинактивация в исследовании мембранных белков. Криоэлектронаня микроскопия. Индексы гидропатии и предсказание вторичной структуры мембранных белков. Рентгеноструктурный анализ.
Диффузия низкомолекулярных соединений через мембраны. Коэффициент проницаемости и скорость диффузии. Пассивный и активный транспорт веществ через мембраны. Классификация переносчиков, каналов и насосов. Ионный состав цитоплазмы и внутренней среды организма. Трансмембранный потенциал и причины его возникновения. Разделение зарядов на мембране. Уравнение Нернста и Доннановское равновесие.
Методы и объекты, используемые для изучения транспортных процессов. Получение изолированных клеток из различных тканей. Клетки животных в культуре, трансформация культивируемых клеток. Тени эритроцитов. Получение замкнутых везикул методом дифференциального центрифугирования, очистка везикул с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Маркеры биологических мембран. Ориентация мембран в везикулах (right-side out и inside out).
Плоские липидные мембраны и липосомы. Классические и обращенные мицеллы. однослойные, малые и крупные многослойные липосомы. Липосомы с встроенными транспортными белками. Ингибирование транспорта в липосомах малых размеров. Ионофоры: валиномицин, нигерицин, монензин, А-23187. Каналообразователи: грамицидин, аламетицин. регистрация транспорта: изотопный метод, оптический метод, регистрация АТРазной активности, токи через плоскую мембрану со встроенным переносчиком, пэтч-клэмп техника.
Принципы пассивного и вторично-активного переноса веществ через мембраны. Переносчики суперсемейства MFS, особенности их структуры и механизм функционирования. Способы анализа аминокислотной последовательности мембранных белков и предсказания их вторичной структуры.
Классификация транспортных АТРаз, их характерные свойства, внутриклеточная локализация, функции. Эволюция АТРаз P-типа. Na,K-АТРаза как представитель гетеродимерных АТРаз Р-типа. Открытие Na,K-АТРазы и ее идентификация как Na-насоса. Частные реакции, осуществляемые Na,K-АТРазой, потоки ионов через Na,K-АТРазу, стехиометрия транспорта в различных условиях. Доказательство существования Е1 и Е2 конформаций. Окклюдированные формы. Схема транспорта и состояние каналов в различных конформациях. Распространение Na,K-АТРазы и ее очистка. Структура Na,K-АТРазы: субъединицы, их упаковка в мембране. Изоформы альфа- и бета-субъединиц Na,K-АТРазы, их распространение и функции. Нуклеотид-связывающий, фосфорилируемый, активаторный и трансмембранные домены Na,K-АТРазы. Трансмембранные фрагменты (19 кДа фрагмент) и их функция. Третичная и четвертичная структура Na,K-АТРазы. Конформационные переходы в молекуле Na,K-АТРазы.
Функции Na,K-насоса в различных тканях: обеспечение поддержания потенциала покоя и потенциала действия, транспорт сахаров и аминокислот, Na/Са- и Na/Н-антипортеры. Положительный инотропный эффект. Участие Na,K-насоса и других транспортеров в поддержании внутриклеточного рН. Участие Na,K-насоса в трансэпителиальном транспорте ионов и малых молекул. Неравномерное распределение Na,K-АТРазы в плазматической мембране поляризованных клеток и участие анкирина в этом процессе. Долговременная и кратковременная регуляция активности Na,K-АТРазы. Регуляция реабсорбции в нефроне. Фосфорилирование Na,K-АТРазы различными протеинкиназами и физиологическое значение этого явления. Роль Na,K-насоса в регуляции объема клетки. Na,K-АТРаза как рецептор для стероидных гормонов. Гены, экспрессия которых запускается ингибированием Na,K-АТРазы. Механизмы, обеспечивающие ответ кардиомиоцитов на связывание уабаина с Na,K-АТРазой. Уабаин и некроз эпителия, возможные механизмы. Роль эндогенных уабаин-подобных соединений в развитии гипертонической болезни.
Системы, обеспечивающие секрецию соляной кислоты париетальными клетками в желудке. Структура Н,К-АТРазы, механизмы активации секреции соляной кислоты. Блокаторы Н2-рецепторов и их действие на секрецию. Семейство необратимых ингибиторов Н,К-АТРазы, механизм их действия на насос. Сравнение свойств различных ингибиторов и их эффектов на Н,К-АТРазу.
Са-АТРаза саркоплазматического ретикулума и ее изоформы. Реакционный цикл Са-АТРазы. Структура молекулы Са-АТРазы и конформационные изменения трансмембранного и цитоплазматического доменов молекулы фермента в процессе функционирования. Особенности кинетики Са-АТРазы. Олигомерная организация фермента. Белки-регуляторы Са-насоса фосфоламбан и сарколипин. Болезни человека, связанные с нарушением обмена Са2+. Са-АТФаза плазматических мембран.
АВС-суперсемейство АТРаз и множественная устойчивость к лекарствам. АВС-АТРазы прокариот и эукариот. MDR1 человека, его структура и механизм работы. Структура генов представителей семейства АВС. Бактериальные флиппазы и пермеазы. Участие периплазматических субстрат-связывающих белков в работе пермеаз. TolC - бактериальный белок, обеспечивающий перенос различных соединений через периплазматическое пространство. Участие белков суперсемейства MFS в лекарственной устойчивости бактерий.
АТРазы V-типа: молекулярная организация и функционирование в сравнении с АТРазами F-типа. Локализация АТРаз V-типа во внутриклеточных мембранах (эндосомы и лизосомы) и в плазматической мембране клеток животных. Роль в эндоцитозе и внутриклеточном транспорте, в проникновении в клетку бактерий и вирусов, в процессинге секретируемых белков и обратном транспорте в синаптосомах. Функции АТРаз V-типа в плазматической мембране остеокластов, макрофагов, интеркалярных клетках почечного эпителия и сенсорных клетках кортиевого органа, в процессе метастазирования опухолей. Регуляция активности путем диссоциации V1-домена, связывания белков Ravе, за счет изменения потенциала на мембране и путем образования внутренних дисульфидных связей.
Н-АТРаза растений, ее роль в поглощении солей корнями растений, регуляция активности за счет аутоингибиторного домена. АТРаза - транспортер ионов Cu как пример АТРаз I подтипа, Cu-АТРаза человека и металлошаперон Atox-1: регуляция функции. Болезнь Вильсона-Коновалова. Белки семейства FXYD, гамма-субъединица Na,K-ATPазы, фосфолеман и CHIF как представители семейства, их функции в реабсобции Na+ в почках. Эволюция АТРаз P-типа.
Ионные каналы, их классификация, особенности структуры. Ионные радиусы и размеры пор ионных каналов. Ионная селективность и механизм работы селективных фильтров. Селективный фильтр, пора и калитка ионных каналов. Принципы работы калитки. Моделирование гидрофильных и гидрофобных калиток в мембранах ('нанопоры'). Представители каналов с гидрофобными и гидрофильными калитками. Лиганд-управляемые ионные каналы, их основные классы. Ацетилхолиновый рецептор: особенности структуры и функционирования. Хлорные каналы (глициновые рецепторы).
Потенциал-чувствительные ионные каналы. Особенности структурной организации потенциал-чувствительных К+-, Na+- и Са2+-каналов. Методы регистрации одиночных каналов. Параметры работы ионных каналов, определяемые в электрофизиологических экспериментах. Потенциал действия. К+-канал дрозофилы Shaker и особенности его работы. Понятие об ион-селективном фильтре канала и принципе его работы. Ион-селективные фильтры К+-каналов. Калитка (ворота) канала и управление ее работой. Конформационные переходы и управление работой калитки. Работа 'сенсора напряжения' потенциал-чувствительных каналов. Регуляция открывания и закрывания калитки.
Каналы, управляемые внутриклеточными сигналами. Участие цГМФ-активируемых каналов в фоторецепции. Предполагаемая структура цГМФ-управляемого канала. Участие цАМФ-активируемых Са-каналов и Са-активируемых Сl-каналов в работе обонятельных рецепторов. Участие РКА-регулируемых К-каналов во вкусовой рецепции. Каналы, управляемые метаболитами липидного обмена. Участие TRP/TRPL-каналов в работе фоторецепторов насекомых.
Роль кальция как вторичного посредника в разных типах клеток и Са-зависимые регуляторные пути. Потенциал-чувствительные Са-каналы плазматической мембраны, их типы и принципы классификации. Субъединичная структура Са-каналов, роль субъединиц, принципы их взаимодействия. Регуляция работы Са-каналов протеинкиназами и цитоплазматическими регуляторными белками (G-белки и белки SNARE). Мутантные формы альфа1-субъединицы Са-каналов P/Q-типа и развитие нейродегенеративных заболеваний (наследственные формы мигрени, мозжечковая и эпизодическая атаксия). Дигидропиридиновые рецепторы и рианодиновые рецепторы. История открытия и идентификации. Роль в электромеханическом сопряжении.
Са-каналы (рианодиновые рецепторы) и Са-АТРаза сарко(эндо)-плазматического ретикулума: молекулярная организация и особенности регуляции. Мембранные ион-транспортирующие системы, участвующие в обмене кальция в разных типах клеток. Структура мышечного волокна и белковый состав мембран саркоплазматического ретикулума: тяжелая и легкая фракции СР. Белки 'соединительных ножек' и рианодиновые рецепторы: идентификация и очистка. Структура рианодинового рецептора. Изоформы рианодинового рецептора, экспрессирующиеся в разных тканях. Активаторы и ингибиторы рианодиновых рецепторов. Криоэлектронная микроскопия. Особенности структурной организации триад в скелетных мышцах и диад в миокарде.
Взаимодействие рианодиновых и дигидропиридиновых рецепторов. Белки-регуляторы рианодиновых рецепторов. Роль Са-связывающих белков (кальмодулин, кальсеквестрин, саркалюменин) в регуляции функциональной активности Са-каналов ретикулума. Механизм электромеханического сропряжения в скелетной и сердечной мышцах. Циклическая АДФ-рибоза как основной активатор Са-каналов в гладких мышцах и немышечных тканях. Регуляция сердечной изоформы рианодинового рецептора протеинкиназой А и сердечная недостаточность. Конфокальная микроскопия и регистрация Са-спарков. Злокачественная гипертермия и Central Core Desease. Нагревательный орган рыб, участие Са-каналов и Са-АТРазы ретикулума в термогенезе.
Рецепторы инозитолтрифосфата. Фосфатидилинозитол как предшественник вторичных посредников. Структура IP3-рецепторов. Функциональные домены IP3-рецепторов. Сходство и различие IP3-рецепторов и рианодиновых рецепторов. Регуляция IP3-рецепторов кальмодулином. Участие IP3-рецепторов в Са-индуцируемом выбросе Са2+ и формировании Са-волны. Возможный механизм заполнения кальцием внутриклеточных депо и участие в этом процессе IP3-рецепторов. Белок Homer и формирование кластеров рецепторов плазматических мембран и внутриклеточных органелл. 'Са-осцилляторы' и совместная работа IP3-рецепторов и рианодиновых рецепторов. Внутриклеточные посредники cADPR и NAADP.
Переносчик глюкозы GLUT1, его структура и основные кинетические свойства. Анализ олигомерной организации мембранных белков и способы исследования их локализации в мембране (Cys-мутагенез). Амфипатические альфа-спирали и формирование гидрофильных полостей в мембране. Семейство переносчиков GLUT-HMIT, распространение, кинетические характеристики, функции в разных тканях, особенности структуры (sugar/polyol transporter signature). Переносчики SGLT и транспорт глюкозы через эпителий в тонком кишечнике и почках. Заболевания, связанные с нарушением работы переносчиков глюкозы, и способы их коррекции. Нарушение поглощения глюкозы и галактозы в кишечнике. Конвульсивные состояния новорожденных и синдром De Vivo. Синдром Фанкони-Бискела. Механизм стимуляции инсулином поглощения глюкозы в скелетных мышцах, сердце, жировой ткани и диабет II типа. АТФ-управляемые К-каналы и инсулинопатии.
Фосфатидилинозитол как предшественник ряда вторичных посредников. IP3-киназа. Два пути стимуляции инсулином встраивания везикул, содержащих переносчик GLUT4, в плазматическую мембрану. Структура переносчика лактозы LacY и особенности его функционирования. Антипортеры и симпортеры. Na/Ca-обменник, его структура и физиологическая роль. Участие НСО3/Сl-антипортера (белок АЕ1, белок полосы III) в транспорте СО2 эритроцитами. Зависимость активности основных мембранных переносчиков, регулирующих внутриклеточный рН, от значения рН цитоплазмы. Участие ионных насосов, антипортеров и каналов в секреции соляной кислоты париетальными клетками желудочных желез. Участие антипортеров и каналов в накоплении солей и сахарозы вакуолями растительных клеток.
Порины. Доказательства существования аквапоринов. Структуры воды и водородные связи. Молекулярная структура канала. Аквопорин как канал без калитки. свойства канала, обеспечивающие проведение воды, но не ионов (включая Н+): селективнй фильтр, электростатичское отталкивание Н+, образование водородных связей с каналом. Разнообразие аквапоринов человека, аквапорины прокариот и растений. Заболевания человека, обеспечиваемые мутациями в аквапоринах (наследственная катаракта, несахарный диабет, сердечная недостаточность, ишемические поражения и водянка мозга, отравления арсенатом).
Литература:
- Lodish H., Berk A., Zipurski S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. Molecular Cell Biology. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. 2001.
- Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. Garland Science. 2002.
- Nelson D.L., Cox M.M. Leninger Principles of Biochemistry. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. 2005.
- Carterall W.A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000. v. 16, p. 521-555.
- MacKinnon R.M. Potassium channels. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 62-65.
- Urwin N. Structure and action of the nicotinic acetylcholine receptor explored by electron microscopy. FEBS Lett. 2003. v. 555, pp. 91-95.
- Cancela M.J. Specific Ca2+ signaling evoked by cholecystokinin and acethylcholine: the roles of NAADP, cADPR, and IP3. Ann. Rev. Physiol. 2001. v. 63, pp. 99-117.
- Matulef K., Zagotta W.N. Cyclic nucleotide gated ion channels. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2003. v. 19, pp. 23-44.
- Hardie R.C. Regulation of TRP channls via lipid second messengers. Ann. Rev. Physiol. 2003. v. 65, pp. 735-759.
- Brown G.K. Glucose transporters: structure, function and consequences of deficiency. J. Inherit. Metab. Dis. 2000. v. 23, pp. 237-246.
- Hruz P.W., Mueckler M.M. Structural analysis of the GLUT1 facilitative glucose transporter. Molec. Membr. Biol. 2001. v. 18, pp. 183-193.
- Wood I.S., Trayhurm P. Glucose transporters (GLUT and SGLT): expanded families of sugar transport proteins. Br. J. Nutr. 2003. v. 89, pp. 3-9.
- Moller J.V., Juul B., le Maire M. Structural organization, ion transport, and energy transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta. 1996. v. 1286, pp. 1-51.
- Lopina O.D. Na,K-ATPase: structure, mrchanism, and regulation. Membr. Cell Biol. 2000. v. 13, pp. 721-744.
- Лопина О.Д. Взаимодействие каталитической субъединицы Na,K-АТРазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами. Биохимия. 2001. т. 66, сс. 1389-1400.
- Toyoshima C., Inesi G. Structural basis of ion pumping by Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 2004. v. 73, pp. 269-292.
- Лопина О.Д., Рубцов А.М. Н,К-АТРаза и регуляция секреции НСl слизистой оболочкой желудка. Биохимия. 1997. т. 62, сс. 1235-1242.
- Thomas U. Modulation of synaptic signalling complexes by Homer protein. J. Neurochem. 2002. v. 81, pp. 407-413.
- Рубцов А.М., Батрукова М.А. Кальцтевые каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума: структура и свойства. Биохимия. 1997. т. 62, сс. 1091-1105.
- Ogawa Y., Kurebayashi N., Murayama T. Ryanodine receptor isoforms in excitation-contraction coupling. Adv. Biophys. 1999. v. 36, pp. 27-64.
- Рубцов А.М. Молекулярные механизмы регуляции активности Са-каналов сарокплазматического ретикулума, утомление мышц и феномен Северина. Биохимия. 2001. т. 66, сс. 1401-1414.
- MacLennan D.H. Ca2+ signalling and muscle disease. Eur. J. Biochem. 2000. v. 267, pp. 5291-5297.
- Theodoulou F.L. Plant ABC transporters. Biochim. Biophys. Acta. 2000. v. 1465, pp. 79-103.
- Chang G. Multidrug resistance ABC transporters. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 102-105.
- Ratajczak R. Structure, function and regulation of the plant vacuolar H+-translocating ATPase. Biochim. Biophys. Acta. 2000. v. 1465, pp. 17-36.
- Nishi T., Forgac M. The vacuolar (H+)-ATPases - nature's most versatile proton pumps. Nature Rev., 2002. v. 3, pp. 94-103.
- Pedersen P.L. Transport ATPases in biology systems and relationship to human disease: a brief overview. J. Bioenerg. Biomembr. 2002. v. 34, pp. 327-332.
- Borgnia M., Nielsen S., Engel A., Arge P. Cellular and molecular biology of aquaporin water channels. Annu. Rev. Biochem. 1999. v. 68, pp. 425-458.
- Arge P., Kozono D. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases. FEBS Letters. 2003. v. 555, pp. 72-78.
- Gonzalez M.E., Carrasco L. Viroporins. FEBS Lett. 2003. v. 552, pp. 28-34.
версия для печати
Страница последний раз обновлялась 02.05.2010