Äîêóìåíò âçÿò èç êýøà ïîèñêîâîé ìàøèíû. Àäðåñ îðèãèíàëüíîãî äîêóìåíòà : http://www.bio.msu.ru/res/Dissertation/427/DOC_FILENAME/vrjesh.pdf Äàòà èçìåíåíèÿ: Tue Feb 14 17:49:41 2012 Äàòà èíäåêñèðîâàíèÿ: Mon Oct 1 20:35:35 2012 Êîäèðîâêà:

mRFP1
03.01.02 ­

-

2012


. .. . : - , : , . .. - : . 22 2012 14 00 501.001.96 . .. : 119991, , . , 1/12, , , , «». . .. . « 501.001.96 .. » 2012 .




, , . . , , , , . ( ). : : ( 450 ) (708 ) . , , , . . , . , .. . , , in silico .

3



mRFP1 in silico in vitro , , - . , : mRFP1 ; PDB- mRFP1, , ; mRFP1 66 ; , 20 mRFP1 66 , , ; 66 ; .


- mRFP1 , . mRFP1 66 . OPLS-AA ( , 4


) - in silico. , / , , . , , , . mRFP1 , 100 000 -1-1. , , .

,
1. - mRFP1 , ; 2. OPLS-AA, - in silico; 3. , / , , ; 4. , .

5



« » 2006 , , «», 2006-2007 .


9 , ,

- 5, ­ 4.


. .


, , . 127 , 35 , 21 27 . 94 .

6



, , . . . . . . . () . GFP D sRed ,

, DsRed . , mRFP1 DsRed. GFP, DsRed mRFP1. ( , ) . . (), GROMACS, OPLS-AA. , - . GROMACS OPLS-AA OPLS-AA/DsRed, . , . - . () , , - . , . 7


















-C_N1_CA1, OPLS-AA / . -. DsRed, - - . , , .. . , . mRFP1, 66 . . . , . . , . . 66 ( ).

8




DsRed . , , OPLS-AA. . ab initio - GAMESS. ab initio - RHF, 6-31G**. DFT B3LYP. , , R.E.D. -, , , , -. DsRed 1. , , . , - . DsRed, , . , OPLS-AA.

9


. 1. DsRed . , Nt
er

­ N- , C

t er

­ -

. . CZ, OH HH (. 1) C , OPLS-AA . CE1, CE2, CD1, CD2, CG2, HE1, HE2, HD1, HD2 CB2 OPLS-AA. CA2 C1, N2, N3 , , C4, N7, N9 OPLS-AA. N1 N3 OPLS-AA . C2 O2 C6 O, , . , , Gln66 DsRed OPLS-AA. CA3 DsRed C- OPLS-AA. DsRed. DsRed - , 10


( -C_N1_CA1, -CA_­C_N1_CA1 C_N1_CA1_C1, ). , , , , . A, (. 2).

. 2. A. , Gln66 DsRed OPLS-AA. , , : CG1, HG11, HG12, CD3, OE1, NE1, HE11, HE12 (. 1), CB1 HB13 (. 2). N1 Phe65 ( DsRed), : -C, -O, -CA -HA. -CA -HA1 HA2 (. 2) . , , - A. 11


A DsRed (PDB ID 1GGX). A A1
GGX

.

, Aeq, A . Aeq, OPLS-AA. Aeq - R.E.D. DsRed OPLS-AA. -C_N1_CA1 Aeq. -C_N1_CA1 (
0

,



, DsRed

= 123.8°) -5°

+5° 1°, . , , B* ( ). - . , , Beq ( ). Aeq -5° +5°, 0° ( Aeq) . (. 3). -CA_-C_N1_CA1 C_N1_CA1_C1 A Aeq, , , 0° 360° 20°, - (. 4).

12


2,5

2,0

V(), /

1,5

1,0

0,5

0,0 -6 -4 -2 0 2 4 6

,

. 3. -C_N1_CA1. , - , ­ .
60

50

40

V, /

30

20

10

0 0 50 100 150 200 250 300 350

,

. 4. -CA_-C_N1_CA1 C_N1_CA1_C1. - -CA_-C_N1_CA1 C_N1_CA1_C1, , ­ .

13












,



. n ( n = 1, 2, ..., 6) -CA_-C_N1_CA1 -C_N1_CA1_C1 DsRed. OPLS-AA/DsRed, , DsRed, 12 510 4.2 , QYGMD, QYGMD,
Average Average

.

, (PDB ID

1ZGO, 1G7K, 1GGX) , , .

mRFP1
mRFP1 , - , , DsRed, SwissPDBViewer. L-BFGS GROMACS. - OPLS-AA/DsRed. , .

. - GROMACS.

mRFP1
mRFP1 pMT-mRFP1, «Fungal Genetics Stock Center», , . - - «-», , , , 14


. - - . . - «-» (. 5), .




SnaBI

P P

I II
P P OH P P III

III

P

IV

4 -

OH

OH

P

1. 2. T4 -

- I

V

VI

. 5. - «-». (« ») ( I . 5). III, ( II . 5). : ( III . 5). - 5'-, - . 3'- , 15














-





( IV . 5). I E.coli - ( V . 5). ­ ( ) , «» - , , « » , 3' 5' . - I E.coli «-» ( VI . 5). 3'- 5'- . «» -. , . - E.coli. , . , , . E.coli, DYT. - ( ) - . . 0.3 1.5 /.


, . 20 (60%) (. 1). , 16


, , , , GFP.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 mRFP1-17D+ A5 4i 7D 11sn 22ss A8 16D 14D 13mn 12mn 5I 11in 5F 10V,8D 39R 13P 19Y 11D 31W N A L C S H G E M K I T F V R P Y D W 595 , 584 570 578 577 568 561 588 504 577 ­ 588 560 ­ 570 595 624 589 624 607 604 605 613 588 579 618 515 610 0.27 0.17 0.19 0.12 0.21 0.21 0.13 0.025 0.34 41 800 6 900 2 400 3 600 35 650 32 700 12 700 16 200 9 000 , , M-1
-1

0.024 0.03 25 000 24 350

0.04 2 430



1. mRFP 66 . , ­ , ­ .


mRFP1 Q66A, Q66L, Q66S, Q66H, Q66C, Q66N : 17


(. 2). , Q66N, , , 500-509 , Q66N 525 . . , , 561-598 66 .
, mRFP1 Q66N Q66H Q66L Q66C Q66A Q66S Q66F Q66T Q66Y Q66E 503 525 504 500 505 500 506 508 509 508 503 34 600 13 700 35 600 64 000 36 400 29 600 24 900 26 600 1 200 57 000 , M-1
-1

, 584 570 588 582 568 582 562 593 561 592 588 41 800 6 900 12 700 3 600 35 650 2 400 32 700 8 000 25 000 2 400 9000 , M-1
-1

, 584 570 588 577 568 578 561 593 560 ­ 570 595 577 ­ 588

, 607 604 618 613 588 605 579 617 589 624 610



0.27 0.17 0.13 0.12 0.21 0.19 0.21 0.03 0.024 0.04 0.34

2. mRFP1 . ­ , ­ . , (. 2). , , , . , ­ . , 18


C N 66 , - 66 , . «» C N 66 «» . ( ) ( ). (. 6). Q66A, Q66L, Q66S, Q66H, Q66C, Q66N, Q66T, Q66Y, Q66F, Q66E 66 0.66, 0.63. (, , ), 0.9 2 0.83, , ­ 0.28 0.69, . , : 1. 2. ( ) 66 Glu215, . , GFP (. 7). GFP , , , , .

19


620

His Glu Asn Gln

610

600

,

590

Cys Ser Cys Ser Asn

Thr Glu

Gln

His

580

570

Thr

560 80

90

100

110

120

,



130
3

140

150

160

. 6. , mRFP1 66 . , ­ .

510 505 500

Ser Ala

Cys

Leu

,

495 490 485 480 475 470 80

Leu Cys Ser Ala
100 120 140
3

,

o

160

180

. 7. () () GFP 65 .

20


- mRFP1
, - , , (-, ). (. . 8).

. 8. 5 å mRFP1, Q66N, Q66C Q66A Q66S. - , 66 215. . Glu215, .. , . , . - , 21


. , , .


­ , 3 - K32. , , . , K32, 3 . , 3 ( ) 3.


, , :

22


532, 570 red, green , ; nred, n
green

­ [-3], n0 ­

, ­ , RS ­ () , D ­ , 0 ­ , l ­ , , . 570 , D, , , .. D = Dred.

[2] = 2.6·1020· [-1-1] , D , , (. 3). , : mRFP1, Q66S Q66C (. 3). mRFP1 , 10-162 , 10-172 , 10-162 , -1-1 n n n
red

Q66C 30.5 1.60.4 5.10.8 13520 0.170.06 0.830.06 1:5 2.80.14 00.02 0.190.04

Q66S 2.20.5 2.30.4 30.5 8513 0.340.06 0.660.06 1:2 2.90.14 0.050.02 0.200.04

3.40.6 2.40.4 6.51.1 21540 0.260.06

/n

0 0

green red

/n

0.740.06 1:3 30.15 00.02 0.240.03

/n

green

3, T

3. mRFP1, Q66C Q66S. 23


mRFP1 ( = 584 ): (8.21.5)·10
-16

[2],

, 21540 [-1-1]. 4

. , ( ), . , . , . . , . , , 66- (. 6), . (. 9).

220

,

-1

Gln
200 180 160 140

-1

Cys
120 100

Ser
80 80 90 100 110 120
o

130

140

150

,

3

. 9. 66 .

24



1. OPLS-AA mRFP1 . - DsRed ( ) - . 2. OPLS-AA 20 66 . 3. 4. PDB- mRFP1 . -

. . , , , , , . , , . 5. - - (mRFP1), pQEM, Gln66. E.coli 20 mRFP1. . 26 , . . 20 12. .. 66 . 6. mRFP1 (Q66C Q66S), «» «» . ( ) 66 , . 25


,

1. , , , , , , , , . . , 2007, 52(5), 792-798. 2. Khrameeva EE, Drutsa VL, Vrzheshch EP, Dmitrienko DV, Vrzheshch PV. Mutants of monomeric red fluorescent protein mRFP1 at residue 66: structure modeling by molecular dynamics and search for correlations with spectral properties Biochemistry, 2008, 73(10), 1085-1095. 3. Dmitrienko DV, Vrzheshch EP, Drutsa VL, Vrzheshch PV. Red fluorescent protein DsRed: parametrization of its chromophore as an amino acid residue for computer modeling in the OPLS-AA force field. Biochemistry, 2006, 71(10), 1133-1152. 4. , , , , , , , . mRFP1. , , 2008, 3, 21-24. 5. Banishev AA, Vrzheshch EP, Shirshin EA. Application of laser fluorimetry for determining the influence of a single amino-acid substitution on the individual photophysical parameters of a fluorescent form of a fluorescent protein mRFP1. Quantum Electronics, 2009, 39(3), 273-278.

26



1. , , . . , «-2006», «», , 2006, , . 157. 2. , , , , , , . mRFP1. « », . .. , , 2006. II, . 42. 3. , , . . « », . .. , , 2006. II, . 51. 4. , . - mRFP1. XIII , «-2006», « », , 2006, , . 10.

27