Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://plantphys.bio.msu.ru/education/respiration.doc Дата изменения: Sat Sep 1 12:55:59 2012 Дата индексирования: Mon Oct 1 19:45:15 2012 Кодировка: koi8-r

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ

Объект: листья или корни высших растений.

Цель работы: определить активность пероксидазы (ПО) в гетеротрофных и
автотрофных тканях; сравнить активность пероксидазы у разных видов высших
растений.

Ход работы:
Навеску растительного материала 50-100 мг (необходимо точно записать
массу) растирают в ступке с небольшим количеством (около 5 мл) 0,06 М
фосфатного буфера, рН 6,7. Растёртую массу количественно переносят в мерную
колбу на 50 мл, доводят до метки тем же буфером, хорошо перемешивают и
оставляют на 15 мин. Затем раствор фильтруют через двойной бумажный фильтр
в стаканчик. Фильтрат (вытяжку) используют для определения активности
фермента.
Активность фермента измеряют фотометрически на ФЭКе при 440 нм. При
окислении некоторых фенолов (например, гваякола) пероксидазой образуется
окрашенный продукт и оптическая плотность раствора при 440 нм
увеличивается. Реакция, проходящая в реакционной среде:
пероксидаза

фенол + Н2О2 ------> хинон + 2Н2О

Для измерения оптической плотности используют три кюветы по 8 мл
(контроль и две химические повторности). В каждую из трёх кювет вносят:
2 мл вытяжки,
2 мл 0,06 М фосфатного буфера, рН 6,7,
2 мл гваякола.

После этого в контрольную кювету вносят 2 мл дистиллированной воды,
устанавливают её внутри ФЭКа и вводят в световой луч. Ручками грубой и
точной настройки нуля устанавливают "0"оптической плотности по контрольной
кювете.
Одну из опытных кювет устанавливают внутри ФЭКа и вводят в световой луч.
Автоматической пипеткой вносят в опытную кювету 2 мл 0,3% раствора перекиси
водорода и одновременно включают секундомер. Записывают значения оптической
плотности через каждые 5 (-20-60) секунд. Необходимо снять 5-10 точек.
Таким же способом измеряют вторую опытную кювету.
Строят график зависимости оптической плотности D440 от времени t. На
графике находят линейный участок и вычисляют скорость изменения оптической
плотности D'440 = (D4402 - D4401) / (t2 - t1). (D'440 вычисляется по
численным значениям, а не измеряется по графику!)
Активность пероксидазы АПО рассчитывают по формуле:

D' * N (ед. опт. плотн.)
АПО = ------ [----------]
mсыр. * lкюв. (г сыр.массы) * (сек)

D'440 - скорость изменения оптической плотности [ед.опт.плот. / сек]
N - разведение
mсыр. - сырая масса навески [г]
lкюв. - толщина кюветы [см] (lкюв. = 2 см)

В выводах указать рассчитанную активность фермента, сравнить активность
фермента в разных органах / видах / условиях выращивания растений,
объяснить возможные причины различий на основе сведений о функциях фермента
в растении.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ

Объект: листья или корни высших растений.

Цель работы: определить активность полифенолоксидазы (ПФО) в гетеротрофных
и автотрофных тканях; сравнить активность полифенолоксидазы у разных видов
высших растений.

Ход работы:
Навеску растительного материала 250-500 мг (необходимо точно записать
массу) растирают в ступке с небольшим количеством (около 5 мл) 0,06 М
фосфатного буфера, рН 7,0-7,4. Растёртую массу количественно переносят в
мерную колбу на 25 мл, доводят до метки тем же буфером, хорошо перемешивают
и оставляют на 15 мин. Затем раствор фильтруют через двойной бумажный
фильтр в стаканчик. Фильтрат (вытяжку) используют для определения
активности фермента.
Активность фермента измеряют фотометрически на ФЭКе при 590 нм. При
окислении фенолов полифенолоксидазой в присутствии диэтилпарафенилендиамина
образуется окрашенный продукт и оптическая плотность при 590 нм
увеличивается. Реакции, проходящие в реакционной среде:

| | | | | | | |
| | | |полифенолоксидаза| |+| |
|2 |+|О2 | |2 | |2 Н2О |
| | | |---------> | | | |
|пирокатехи| | | |ортохинон| | |
|н | | | | | | |
|[pic] | |[pic] | |[pic] | |[pic] |
| | | | | | | |
| |+| |---------> | |+| |
|ортохинон | |парафениле| |пирокатех| |окрашенны|
| | |н- диамин | |ин | |й продукт|

Для измерения оптической плотности используют три кюветы по 8 мл
(контроль и две химические повторности). В каждую из трёх кювет вносят:
2 мл вытяжки,
2 мл 0,06 М фосфатного буфера, рН 7,0 -7,4,
2 мл 0,02% раствора диэтилпарафенилендиамина.

После этого в контрольную кювету вносят 2 мл дистиллированной воды,
устанавливают её внутри ФЭКа и вводят в световой луч. Ручками грубой и
точной настройки нуля устанавливают "0"оптической плотности по контрольной
кювете.

Одну из опытных кювет устанавливают внутри ФЭКа и вводят в световой луч.
Автоматической пипеткой вносят в опытную кювету 2 мл 1% раствора
пирокатехина и одновременно включают секундомер. Записывают значения
оптической плотности через каждые 5 (-20-60) секунд. Необходимо снять 5-10
точек. Таким же способом измеряют вторую опытную кювету.
Строят график зависимости оптической плотности D590 от времени t. На
графике находят линейный участок и вычисляют скорость изменения оптической
плотности D'590 = (D5902 - D5901) / (t2 - t1). (D'590 вычисляется по
численным значениям, а не измеряется по графику!)
Активность полифенолоксидазы АПФО рассчитывают по формуле:

D' * N (ед. опт. плотн.)
АПФО = ------ [----------]
mсыр. * lкюв. (г сыр.массы) * (сек)

D'590 - скорость изменения оптической плотности [ед.опт.плот. / сек]
N - разведение
mсыр. - сырая масса навески [г]
lкюв. - толщина кюветы [см] (lкюв. = 2 см)

В выводах указать рассчитанную активность фермента, сравнить активность
фермента в разных органах / видах / условиях выращивания растений,
объяснить возможные причины различий на основе сведений о функциях фермента
в растении.


Литература:
Физиология растений: учебник для студ. вузов. Под ред. И.П. Ермакова. -
М.: Издательский центр "Академия", 2005 или 2007:
. реакция сверхчувствительности - с. 464-465, 617-619;
. вторичный метаболизм - с. 588-593;
. лигнин - с. 81-81, с. 600 (рис.);
. АФК - с. 261-271.