Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://plantphys.bio.msu.ru/education/hill.doc Дата изменения: Thu Sep 25 20:04:31 2014 Дата индексирования: Sat Apr 9 22:25:35 2016 Кодировка: koi8-r

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ПОТОКА ЭЛЕКТРОНОВ
В ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ ХЛОРОПЛАСТОВ
КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
(реакция Хилла)

Объект: листья гороха посевного Pisum sativum L.

Цель: определить скорость потока электронов в электрон-транспортной цепи
фотосинтеза по скорости восстановления искусственного акцептора электронов
(K3Fe(CN)6) колориметрическим методом при:
а) базальном транспорте;
б) сопряжённом транспорте.

Ход работы:

ВЫДЕЛЕНИЕ ХЛОРОПЛАСТОВ

(ВНИМАНИЕ! Все процедуры выделения хлоропластов ведут при 0-5њ С).

1. Получение гомогената.
Навеску листьев 4 г (предварительно охлажденных в холодильнике в течение
10-15 минут

в полиэтиленовом пакете или во влажной фильтровальной бумаге) растирают в
фарфоровой ступке на льду в течение 1-2 минут с 25 мл среды выделения (0,30
М NaCl в 0,06М фосфатном буфере рН 8,04). Полученный гомогенат фильтруют
через капроновое полотно

в центрифужную пробирку.

2. Получение суспензии хлоропластов методом дифференциального
центрифугирования.
Фильтрат в центрифужной пробирке уравновешивают другой центрифужной
пробиркой

с водой. Проводят центрифугирование при 5000 об/мин в течение 2 минут.
Супернатант отбрасывают, а осадок, содержащий хлоропласты, аккуратно
размешивают кисточкой

в центрифужной пробирке с 25 мл среды выделения.

(ВНИМАНИЕ! Суспензию хлоропластов хранить в течение всех экспериментов в
темноте на ледяной бане).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ПОТОКА ЭЛЕКТРОНОВ

Варианты:
1, 2) Свет + АДФ (2 повторности) - сопряженный поток электронов
3, 4) Свет - АДФ (2 повторности) - базальный поток электронов
5) Темнота + АДФ - контроль
6) Темнота - АДФ - контроль

Опыты проводят в конических колбах небольшого объёма. В каждую колбу
наливают реакционную смесь. Состав реакционной смеси (на 1 колбу):


|Компоненты смеси |+ АДФ |( АДФ |
|среда выделения |2,8 мл |2,9 мл |
|MgCl2 |0,1 мл |0,1 мл |
|K3Fe(CN)6 |1,0 мл |1,0 мл |
|АДФ |0,1 мл |- |
|суспензия |1,0 мл |1,0 мл |
|хлоропластов | | |
Темновые варианты помещают в темноту на 10 мин, а световые освещают в
течение 10 мин

на спец. установке. После выключения света во все варианты (и темновые, и
световые) сразу добавляют по 1 мл 20% ТХУ (трихлоруксусная кислота) и 2 мл
1М CH3COONa для того, чтобы остановить реакцию. (!) После каждого
добавления тщательно перемешивать.
Пробы фильтруют через двойные бумажные фильтры в стаканчики.
Оптическую плотность полученных фильтратов измеряют на ФЭКе при 400 нм.
Контроль - вода (lкюв.= 0,5 см).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛА В СУСПЕНЗИИ ХЛОРОПЛАСТОВ

В мерную пробирку вносят 0,5 мл суспензии хлоропластов, 1,5 мл
дистиллированной воды, 100%-ым ацетоном доводят объём до 10 мл. Раствор
хорошо перемешивают и фильтруют

в коническую мерную пробирку через стеклянный фильтр ? 2 или ? 3. Доводят
объём фильтрата до 10 мл 100%-ым ацетоном, перемешивают. Полученный
фильтрат промеряют на спектрофотометре при длине волны 652 нм (контроль -
80% ацетон). Концентрацию хлорофилла в суспензии хлоропластов рассчитывают
по формуле Арнона (Arnon, 1949):

cChl = 0,58 * D652 [мг Chl/мл суспензии]

РАСЧЁТ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ СКОРОСТИ ПОТОКА ЭЛЕКТРОНОВ В ЭТЦ
ХЛОРОПЛАСТОВ
Количество (мкмоль) восстановленного K3Fe(CN)6 определяют по формуле:

(D400 темнота + АДФ - D400 свет + АДФ) * V [мл]
? = ----------------- = [мкмоль K3Fe(CN)6] при сопряжённом транспорте
?400 [л ммоль-1 см-1] * l [см]

(D400 темнота - АДФ - D400 свет - АДФ) * V [мл]
? = ----------------- = [мкмоль K3Fe(CN)6] при базальном транспорте
?400 [л ммоль-1 см-1] * l [см]

V = 8 мл - объём раствора
?400 = 1,04 л ммоль-1 см-1 - коэффициент милимолярной экстинкции K3Fe(CN)6
при ? = 400 нм;
l = 0,5 см - длина оптического пути (= толщина кюветы)


мкмоль K3Fe(CN)6
Скорость потока электронов в ЭТЦ vсопр. и vбаз. выражают в [---------].

мг хлорофилла • час

В выводах указать рассчитанные скорости сопряжённого (vсопр.) и базального
(vбаз.) транспорта электронов, соотношение скоростей vсопр./vбаз. Объяснить
результаты на основе теоретических знаний о работе ЭТЦ.

Литература:
Физиология растений: учебник для студ. вузов. Под ред. И.П. Ермакова. -
М.: Издательский центр "Академия", 2005 или 2007:
. электрон-транспортная цепь фотосинтеза - с. 163-179, 185-190;
. АТФ-синтаза - с. 95-99.