Basic Local Alignment Search Tool Proteins. Поиск гипотетических гомологов.

В ходе исследования использовалась программа BLASTP на сервере NCBI.

• Поиск гипотетических гомологов изучаемого белка "Chaperone protein clpB" в разных БД.

  Подаю на вход программе BLASTP код доступа изучаемого белка (AC - P63284). При этом я провожу поиск гомологов в банках: Swiss-Prot, PDB и "nr". Результаты представлены в виде таблицы 1.
  
  Таблица 1. Результаты поиска гипотетических гомологов белка clpB_Ecoli

  	Поиск по БД SwissProt	Поиск по БД PDB	Поиск по БД "nr"
  Лучшая находка
  Идентификатор БД	CLPB_ECOLI	1QVR	NP_289147
  E-value	0.0	0.0	0.0
  Вес (в битах)	1732	926	1733
  % идентичности	100	56	100
  Найдены ли другие белки с теми же значениями E-value и веса в битах?	Найден белок CLPB_SHIFL c АС - Q7UBW5 в sp	Да, имеются PDB кристалических структур, которые указаны в документе sp для моего белка. Это, изученная мной, запись 1JBK|A c E-Value 3e-108, вес в битах - 389 и еще запись 1KHY|A c E-Value 1e-78, вес в битах - 290, которую я тоже смотрел в RasMol'е и могу сказать, что этот документ, представляет пространственную структуру из 4 олигомеров N1-домена.* Здесь можно найти картинку	Имеются с одинаковым E-value,но отлич. в весе на 1 бит: 10 шт. Пример: YP_541912 c весом 1732
  Сколько хороших кандидатов в гомологи найдено? (число находок в списке описаний, Descriptions, с E-value<=1E-10)	179	5	3858
  "Худшая" находка (последняя в выдаче с E-value ≤ 1.0)
  	Поиск по БД Swiss-Prot	Поиск по БД PDB	Поиск по БД "nr"
  Номер находки в списке описаний (Descriptions)	598	29	5327
  Идентификатор БД	CLPX_STRA5	2Z83	YP_002785159
  E-value	1.0	0.92 Интересно: E-value увеличился за последние 2 недели(25.03.09-7.04.09) на 0.01 = 0.93 На глазах растет база данных. :-)	1.0
  Вес (в битах)	35.8	32.0	40.0
  % идентичности	22	31
  % сходства	40	50
  Длина выравнивания	358	82
  Координаты выравнивания (номера первых и последних а.о.)	Query: 527-825 Sbjct: 41-374	Query: 323-397 Sbjct: 42-121
  % гэпов	23	10

  Белок с AC - P63284 был успешно найден во всех БД. Различия, которые наблюдаются при сравнении выравниваний, связаны с тем, что, например, в PDB находилась запись цепочки А (N - концевой домен), а не весь белок, поэтому и вес и другие результаты для PDB выравнивания относительно малы. В основном причина в этом. Cамое наименьшее кол-во кандидатов в гомологи в БД PDB. Вероятно, это связано с ее малым размером.

  Худшие находки в разных БД разные. Самая лучшая "худшая находка" нашлась в БД PDB.

• Поиск гипотетических гомологов изучаемого белка с фильтром по таксонам

  Задача - для изучаемого белка CLPB_ECOLI найти лучшего гомолога в организмах таксона, филогенетически как можно более далекого от E. coli.
  Для исследования предлагаются следующие таксоны:

  • Homo sapiens
  • Archaea
  • Actinobacteria
  • Alteromonadales
  • Vibrionaceae
  
  Критерий гомологичности: E-value<0,001

  Сначала я решил поискать в авторитетной БД - SwissProt. Для этого я подал программе BLASTP ac - P63284. При этом я ограничился для начала таксоном Homo sapiens. С данным таксоном и БД мне повезло - нашелся белок CLPB_HUMAN с E-value = 5*10^-56. Думаю, что этот белок - гомолог моего белка. Согласно заданию, я остановился. Результаты исследования находятся в табл. 2.

  Таблица 2. Результаты поиска гипотетического гомолога белка clpB_Ecoli в таксоне Homo sapiens   Поиск по БД SwissProt Идентификатор БД CLPB_HUMAN *AC - Q9H078 E-value 5e-56 Вес (в битах) 216 % идентичности 37 % сходства 57 Длина выравнивания 318 Координаты выравнивания (номера первых и последних а.о.) Query: 562-850 Sbjct: 339-655 % гэпов 9

  Белок CLPB_HUMAN, также как CLPB_ECOLI, относится к семейству clpA/clpB. Функция: Возможно, белок - регуляторная АТФаза, и возможно, что имеет отношение к секреции и/или внутриклеточному транспорту белков. По данным записи UniProt*

• Поиск белка по его фрагменту

  На первом занятии 2 блока мне были даны фрагменты последовательностей:
  >seq1
  IMTSNLGSDLIQERFGELDY
  >seq2
  IMTSNIGSQVLLENVKETGE
  

  Моя задача - определить, из какого белка был взят второй фрагмент (seq2), и получить его полную последовательность в формате FASTA.

  Программе BLASTP подаю фрагмент последовательности: IMTSNIGSQVLLENVKETGE; провожу поиск в БД SwissProt. Результаты поиска находятся в табл. 3(Первый столбец).

  Таблица 3. Результаты поиска белка в Swiss-Prot по фрагменту последовательности.

  	Поиск по фрагменту	Поиск по полной последовательности
  АС лучшей находки	Выдал 4 белка с одинаковым E-value, весом и % идентичности, сходства. Самый первый AC - Q6GAV1	Q6GAV1
  E-value	2e-11	0.0
  Вес (в битах)	66.0	1768
  Найдены ли другие белки с теми же значениями E-value и веса в битах?	Да! Q6GIB2 Q8NXE7 Q7A6G6 Судя по данным записи sw, различия заключаются в том, что белки из разных штаммов таксона Staphylococcus aureus.	Найдены с E-value 0.0, но отличающиеся в замене на 1, 16 а.о. Вероятно, в этом и заключается небольшие межштаммовые различия в белках.

  Последовательность белка CLPB_STAAS (AC - Q6GAV1) в формате FASTA:

  >CLPB_STAAS Chaperone protein clpB;
  MDINKMTYAVQSALQQAVELSQQHKLQNIEIEAILSAALNESESLYKSILERANIEVDQL
  NKAYEDKLNTYASVEGDNIQYGQYISQQANQLITKAESYMKEYEDEYISMEHILRSAMDI
  DQTTKHYINNKVEVIKEIIKKVRGGNHVTSQNPEVNYEALAKYGRDLVEEVRQGKMDPVI
  GRDEEIRNTIRILSRKTKNNPVLIGEPGVGKTAIVEGLAQRIVKKDVPESLLDKTVFELD
  LSALVAGAKYRGEFEERLKAVLKEVKESDGRIILFIDEIHMLVGAGKTDGAMDAGNMLKP
  MLARGELHCIGATTLNEYREYIEKDSALERRFQKVAVSEPDVEDTISILRGLKERYEVYH
  GVRIQDRALVAAAELSDRYITDRFLPDKAIDLVDQACATIRTEMGSNPTELDQVNRRVMQ
  LEIEESALKNESDNASKQRLQELQEELANEKEKQAALQSRVESEKEKIANLQEKRAQLDE
  SRQALEDAQTNNNLEKAAELQYGTIPQLEKELRELEDNFQDEQGEDTDRMIREVVTDEEI
  GDIVSQWTGIPVSKLVETEREKLLHLSDILHKRVVGQDKAVDLVSDAVVRARAGIKDPNR
  PIGSFLFLGPTGVGKTELAKSLAASLFDSEKHMIRIDMSEYMEKHAVSRLIGAPPGYIGH
  DEGGQLTEAVRRNPYSVILLDEVEKAHTDVFNVLLQILDEGRLTDSKGRSVDFKNTIIIM
  TSNIGSQVLLENVKETGEITESTEKAVMTSLNAYFKPEILNRMDDIVLFKPLSIDDMSMI
  VDKILTQLNIRLLEQRISIEVSDDAKAWLGQEAYEPQYGARPLKRFVQRQIETPLARMMI
  KEGFPEGTTIKVNLNSDNNLTFNVEKIHE

  Далее, я попытался поискать гипотетических гомологов полной последовательности в БД swissprot. Результаты в табл. 3(Второй столбец).

  Различия между двумя выравниваниями заключаются в том, что вес и E-value гараздо лучше в поиске по полной последовательности, чем по ее фрагменту т.к. длина полностью совпавшей последовательности больше.

  Выравнивание полной последовательности с clpB_Ecoli.

  Query  1    MDINKMTYAVQSALQQAVELSQQHKLQNIEIEAILSAALNESESLYKSILERANIEVDQL  60
              M ++++T   Q AL  A  L+  H  Q IE   ++SA LN+       +L  A I   QL
  Sbjct  1    MRLDRLTNKFQLALADAQSLALGHDNQFIEPLHLMSALLNQEGGSVSPLLTSAGINAGQL  60
  
  Query  61   NKAYEDKLNTYASVEG--DNIQYGQYISQQANQLITKAESYMKEYEDEYISMEHILRSAM  118
                     LN    VEG   ++Q     SQ   +++   +   ++  D +IS E  + +A+
  Sbjct  61   RTDINQALNRLPQVEGTGGDVQP----SQDLVRVLNLCDKLAQKRGDNFISSELFVLAAL  116
  
  Query  119  DIDQTTKHYI---NNKVEVIKEIIKKVRGGNHVTSQNPEVNYEALAKYGRDLVEEVRQGK  175
              +   T    +         I + I+++RGG  V  Q  E   +AL KY  DL E   QGK
  Sbjct  117  ESRGTLADILKAAGATTANITQAIEQMRGGESVNDQGAEDQRQALKKYTIDLTERAEQGK  176
  
  Query  176  MDPVIGRDEEIRNTIRILSRKTKNNPVLIGEPGVGKTAIVEGLAQRIVKKDVPESLLDKT  235
              +DPVIGRDEEIR TI++L R+TKNNPVLIGEPGVGKTAIVEGLAQRI+  +VPE L  +
  Sbjct  177  LDPVIGRDEEIRRTIQVLQRRTKNNPVLIGEPGVGKTAIVEGLAQRIINGEVPEGLKGRR  236
  
  Query  236  VFELDLSALVAGAKYRGEFEERLKAVLKEVKESDGRIILFIDEIHMLVGAGKTDGAMDAG  295
              V  LD+ ALVAGAKYRGEFEERLK VL ++ + +G +ILFIDE+H +VGAGK DGAMDAG
  Sbjct  237  VLALDMGALVAGAKYRGEFEERLKGVLNDLAKQEGNVILFIDELHTMVGAGKADGAMDAG  296
  
  Query  296  NMLKPMLARGELHCIGATTLNEYREYIEKDSALERRFQKVAVSEPDVEDTISILRGLKER  355
              NMLKP LARGELHC+GATTL+EYR+YIEKD+ALERRFQKV V+EP VEDTI+ILRGLKER
  Sbjct  297  NMLKPALARGELHCVGATTLDEYRQYIEKDAALERRFQKVFVAEPSVEDTIAILRGLKER  356
  
  Query  356  YEVYHGVRIQDRALVAAAELSDRYITDRFLPDKAIDLVDQACATIRTEMGSNPTELDQVN  415
              YE++H V+I D A+VAAA LS RYI DR LPDKAIDL+D+A ++IR ++ S P ELD+++
  Sbjct  357  YELHHHVQITDPAIVAAATLSHRYIADRQLPDKAIDLIDEAASSIRMQIDSKPEELDRLD  416
  
  Query  416  RRVMQLEIEESALKNESDNASKQRLQELQEELANEKEKQAALQSRVESEKEKIANLQEKR  475
              RR++QL++E+ AL  ESD ASK+RL  L EEL++++ + + L+   ++EK  ++  Q  +
  Sbjct  417  RRIIQLKLEQQALMKESDEASKKRLDMLNEELSDKERQYSELEEEWKAEKASLSGTQTIK  476
  
  Query  476  AQLDESRQALEDAQTNNNLEKAAELQYGTIPQLEKELRELEDNFQDEQGEDTDRMIREVV  535
              A+L++++ A+E A+   +L + +ELQYG IP+LEK   +LE   Q E    T R++R  V
  Sbjct  477  AELEQAKIAIEQARRVGDLARMSELQYGKIPELEK---QLEAATQLEG--KTMRLLRNKV  531
  
  Query  536  TDEEIGDIVSQWTGIPVSKLVETEREKLLHLSDILHKRVVGQDKAVDLVSDAVVRARAGI  595
              TD EI +++++WTGIPVS+++E+EREKLL +   LH RV+GQ++AVD VS+A+ R+RAG+
  Sbjct  532  TDAEIAEVLARWTGIPVSRMMESEREKLLRMEQELHHRVIGQNEAVDAVSNAIRRSRAGL  591
  
  Query  596  KDPNRPIGSFLFLGPTGVGKTELAKSLAASLFDSEKHMIRIDMSEYMEKHAVSRLIGAPP  655
               DPNRPIGSFLFLGPTGVGKTEL K+LA  +FDS++ M+RIDMSE+MEKH+VSRL+GAPP
  Sbjct  592  ADPNRPIGSFLFLGPTGVGKTELCKALANFMFDSDEAMVRIDMSEFMEKHSVSRLVGAPP  651
  
  Query  656  GYIGHDEGGQLTEAVRRNPYSVILLDEVEKAHTDVFNVLLQILDEGRLTDSKGRSVDFKN  715
              GY+G++EGG LTEAVRR PYSVILLDEVEKAH DVFN+LLQ+LD+GRLTD +GR+VDF+N
  Sbjct  652  GYVGYEEGGYLTEAVRRRPYSVILLDEVEKAHPDVFNILLQVLDDGRLTDGQGRTVDFRN  711
  
  Query  716  TIIIMTSNIGSQVLLENVKETGEITESTEKAVMTSLNAY-FKPEILNRMDDIVLFKPLSI  774
              T++IMTSN+GS ++ E     GE+  +  K ++  + ++ F+PE +NR+D++V+F PL
  Sbjct  712  TVVIMTSNLGSDLIQERF---GELDYAHMKELVLGVVSHNFRPEFINRIDEVVVFHPLGE  768
  
  Query  775  DDMSMIVDKILTQLNIRLLEQRISIEVSDDAKAWLGQEAYEPQYGARPLKRFVQRQIETP  834
                ++ I    L +L  RL E+   I +SD+A   L +  Y+P YGARPLKR +Q+QIE P
  Sbjct  769  QHIASIAQIQLKRLYKRLEERGYEIHISDEALKLLSENGYDPVYGARPLKRAIQQQIENP  828
  
  Query  835  LARMMIKEGFPEGTTIKVNLNSD  857
              LA+ ++      G  I++ +N D
  Sbjct  829  LAQQILSGELVPGKVIRLEVNED  851
  

  Выравнивание, построенное при помощи BLASTP, почти совпадает с моим оптимальным:
  
  У меня гэп идет после 13 E в верхней цепи, а PLASTP передвинул RF до E в нижней цепи, что соответствует моей верхней. И еще т.к. у меня были ограничения в последовательности(20), то в нижней послед. есть концевые гэпы, а послед., вырав. при помощи BLASTP, их нет.

• Сравнение выравниваний, выданных программой BLASTP, с оптимальными глобальным и локальным выравниваниями

  Попытаюсь сравнить выравнивание, выданное BLASTP,

  • с оптимальным частичным выравниванием;
    

    Используя water, получилось выравнивание*:

    # Program: water
    ...
    # Report_file: costa.water
    ...
    # Aligned_sequences: 2
    # 1: CLPB_ECOLI
    # 2: CLPB_STAAS
    # Matrix: EBLOSUM62
    # Gap_penalty: 11.0
    # Extend_penalty: 1.0
    #
    # Length: 863
    # Identity:     452/863 (52.4%)
    # Similarity:   616/863 (71.4%)
    # Gaps:          18/863 ( 2.1%)
    # Score: 2221.0
    ...
    

  • с оптимальным полным выравниванием, сделанных с заданием тех же значений штрафов за создание и удлинение гэпа, которыми пользовался BLASTP.

    Используя needle, получилось выравнивание*:

    # Program: needle
    ...
    # Report_file: costa.needle
    ...
    # Aligned_sequences: 2
    # 1: CLPB_ECOLI
    # 2: CLPB_STAAS
    # Matrix: EBLOSUM62
    # Gap_penalty: 11.0
    # Extend_penalty: 1.0
    #
    # Length: 875
    # Identity:     452/875 (51.7%)
    # Similarity:   617/875 (70.5%)
    # Gaps:          24/875 ( 2.7%)
    # Score: 2218.0
    ...
    

  Таблица 4. Сравнение выравниваний.

  	BLASTP	WATER	NEEDLE
  Длина выравнивания:	863	863	875
  % идентичности	52.0	52.4	51.7
  % сходства	71.0	71.4	70.5
  % гэпов	2.0	2.1	2.7
  Вес	2269.0	2221.0	2218.0

  Из табл.4 видно, что выравнивания отличаются. Длина выравниваний, построенных при помощи BLASTP и WATER одинаковы, а у NEEDLE больше. % гэпов увеличивается в ряду: BLASTP-WATER-NEEDLE, а вес уменьшается. % идентичности, сходства уменьшается в ряду: WATER-BLASTP-NEEDLE.