Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.su/FBB/StudentScience/diplom_2009/Meshalkina.doc Дата изменения: Mon Apr 20 19:51:58 2009 Дата индексирования: Mon Oct 1 23:24:29 2012 Кодировка: koi8-r

Тема дипломной работы: «Некоторые свойства рекомбинантной транскетолазы
нормальных тканей человека»

Руководитель: к.б.н., ст.н.сотр. Отдела биохимии животной клетки НИИ
ФХБ им.А.Н.Белозерского МГУ Мешалкина Л.Е.

Транскетолаза (ТК) - ключевой фермент неокислительной ветви
пентозофосфатного пути превращения углеводов. Функцию его кофакторов
выполняют тиаминдифосфат (ТДФ) и ионы двухвалентных металлов. Наиболее
полно исследованы свойства ТК пекарских дрожжей. Это был первый ТДФ-
зависимый фермент, для которого в 1992 г. был сделан рентгеноструктурный
анализ. В настоящее время его можно считать модельным ферментом, на котором
отрабатываются основные приемы, необходимые для изучения свойств ТК из
любого другого источника. ТК человека исследована недостаточно, в основном
в прикладном плане, в связи с нейро-дегенеративными заболеваниями. Хотя уже
в 1993 году была предложена система гетерологичной экпрессии гена ТК
человека в клетках E.coli, никаких новых публикаций по свойствам этого
фермента в последнее время не было. Определенный интерес к ТК человека
связан, кроме всего прочего, с ее предполагаемой ролью в развитии
опухолевой ткани. Рост опухолевой ткани сопровождается повышением в ней
величины транскетолазной активности. Под действием ингибиторов ТК рост
опухоли существенно замедляется. Таким образом, функционирование ТК
непосредственно связано с образованием и развитием опухоли.
В процессе выполнения дипломной работы предполагается
усовершенствовать метод выделения рекомбинантной транскетолазы нормальных
тканей человека (hTК) и исследовать общие свойства фермента.
Будет отработан метод получения рекомбинантной hTK (совместно с
ведущим научным сотрудником отдела химии нуклеиновых кислот НИИ ФХБ им.А.Н.
Белозерского Друца В.Л.)
Для этого планируется:
- клонировать ген hTK в экспрессионных векторах pDEST (обеспечивает
экспрессию целевого белка с 6-His-модулем) и pTYB (обеспечивает
экспрессию белка с IMPACT-модулем);
- создать продуценты в E.coli рекомбинантной hTK и разработать технику
ее получения в нативных условиях;
- выделить гомогенную hTK в нативных условиях в препаративных
количествах.

Будут исследованы следующие свойства hTК:
- взаимодействие кофермента, ТДФ, с апобелком;
- взаимодействие фермента с субстратами, кинетика катализируемой реакции
- потребность в Me2+ для катализа;
- субстратная специфичность;
- оптические свойства, их изменения в результате взаимодействия
апофермента
с ТДФ и холофермента с субстратами.

Предполагаемые методы исследования:
1. Выделение фермента с использованием Ni-агарозы, характеристика
гомогенности полученного препарата методом ЭФ в присутствии SDS.
2. Регистрация активности транскетолазы в двух системах: в сопряженной
системе со вспомогательным ферментом, глицеральдегидфосфатдегидро- геназой,
и в окислительной системе с феррицианидом (на спектрофотометре Aminco DW
2000, USA).
3. Регистрация индуцированной оптической активности hTК при
взаимодействии апофермента с ТДФ и кинетики образования продукта реакции
транскетолазной реакции методом кругового дихроизма (на дихрографе Mark V ,
Jobin Ivon, France)