На главную страницу
На главную страницу первого семестра

Изображение области связывания НАДФа с цепью A шикиматдегидрогеназы

На этом рисунке изображена зона контакта лиганда – молекулы НАДФа и цепи A белка шикиматдегидрогеназа. В проволочной модели изображен НАДФ и контактирующие с ним аминокислотные остатки. Контактирующие с НАДФом атомы показаны шариками, окрашенными по типу элемента. В проволочной и шариковой модели изображен другой лиганд – DTT. Кратко о выделении этой области: выделив близкие к НАДФу аминокислотные остатки, изучил их взаимодействие с лигандом. Так получил список аминокислот, взаимодействующих с НАДФом и DTT.

План генноинженерного эксперимента

1) Описание области контакта

Водородные связи образуются при расстоянии между атомами менее 3,5Å, гидрофобные взаимодействия возникают при расстоянии между неполярными группами менее 5,0Å.

Валин ?62 взаимодействует с другим остатком сахара (рибоза) в молекуле НАДФа. В pdb-структуре учтены две возможные конформации белка. С сахаром сильнее взаимодействует валин в конформации 'B', так как расстояние между гидрофобными группами в таком случае меньше.

Лиганд DTT тоже взаимодействует с молекулой НАДФа. Между одной из OH групп в DTT (донор протона) и кислородом из никотинамидной группы НАДФа (акцептор протона) возникант водородная связь.

2) План эксперимента

Замена гидрофильных аминокислотных остатков, участвующих в образовании водородных связей с лигандом, на гидрофобные, приведет к потере способности образовывать водородные связи. Например, аспарагин ?149 образует две водородные связи - с атомом кислорода фосфатной группы (азот из амидной группы аспарагина - донор протона) и с гидроксильной группой сахара (кислород из амидной группы аспарагина - акцептор протона). Замена его на гидрофобный аминокислотный остаток приведет к желаемому результату. Примером такого остатка может быть лейцин.Он неполярен и схож по размерам и форме с аспарагином, поэтому не сможет образовывать водородные связи (если заменить аспарагин на очень большой остаток, то это может повлечь за собой значительные пространственные перестройки. А замена на лейцин, вероятно, затронет только зону контакта протеина и лиганда).

Замена аргинина ?154 на глутамин не приведет к изменению способности протеина связываться с НАДФом. Это объясняется тем, что глутамин (точнее, его аминогруппа), как и аргинин, может быть донором протона и образовывать водородную связь с кислородом фосфатной группы. Однако прочность этой связи ниже, чем у аргинина, так как глутамин меньше аргинина (взаимодействующие атомы расположены дальше друг от друга).

Замена лейцина ?241 на изолейцин или валин не повлияет на контакт протеина с лигандом, так как положение атома азота (донор протона при образовании водородной связи) не изменится, а размеры этих аминокислотных остатковсхожи).

Наоборот, замена гидрофобных аминокислотных остатков, участвующих в гидрофобных взаимодействиях с лигандом, на гидрофильные, приведет к нарушению этих взаимодействий и потере способности полипептида связываться с НАДФом.

Примером такой замены может быть замена 62-го аминокислотного остатка (валин) на гидрофильный, который не может быть донором протона. Тогда гидрофобные взаимодействия нарушатся, а водородные связи с фосфатными группами не возникнут. Один из таких аминокислотных остатков - аспарагиновая кислота. Глутаминовая кислота в этом плане хуже, так как крупнее, чем валин. Поэтому предсказать результат сложнее (возможно, такая замена поведет за собой значительные пространственные перестройки).

С другой стороны, замена валина на лейцин только усилит гидрофобные взаимодействия, так как расстояние между неполярными группами уменьшится.

Метионин ?240 гидрофобно взаимодействует с никотинамидной группы НАДФа. Замена метионина на другой гидрофобный аминокислотный остаток, схожий с ним по размеру, не приведет к серьезным изменениям в данном взаимодействии. Например, метионин можно заменить на лейцин.

Как было сказано ранее, лиганд DTT взаимодействует с молекулой НАДФа, образуя водородную связь. Сам DTT связан с протеином ионной связью (с треонином ?61). Если заменить треонин на неполярный аминокислотный остаток, например, валин или аланин, то DTT не сможет связываться с протеином. Поэтому нарушится взаимодействие DTT и НАДФа.