-назад-

Что кодирует фрагмент нуклеотидной последовательности?

#Зачетное задание блока ?1
#Вариант 2

• Дано: неаннотированный фрагмент генома бактерии Yersinia intermedia, протеом бактерии-прототипа.

• Задача: получить заданный фрагмент генома Yersinia intermedia длины 7000 нуклеотидов с помощью программы seqret и определить, есть ли в этом фрагменте гены, похожие на гены бактерии-прототипа Escherichia coli K-12.

• Выбор инструментов для решения поставленной задачи, а также тип данных, по которому целесообразно вести поиск:
  
  a) Дан фрагмент генома бактерии Yersinia intermedia длиной 7000 нуклеотидов. Соответственно,необходимо найти похожие участки нуклеотидной последовательности фрагмента, кодирующие белки, похожие на белки протеома бактерии-прототипа. Данные на вход (subject) - фрагмент генома бактерии Yersinia intermedia. Индексные файлы составляются по полному протеому Escherichia coli K-12.
  
  b) Для решения задачи выбрана программа BLASTP из пакета BLAST. На вход программе будет подаваться транслированные рамки считывания фрагмента, тип базы данных, по которой будет проводиться поиск - белки (протеом бактерии-прототипа).
  
  с) Необходимые команды:

  • Получение фрагмента 126001..133001 генома бактерии Yersinia intermedia. Файл на выходе fragment7000.fasta.

    seqret AALF01000002.embl -sask

  • Получение полного протеома бактерии-прототипа Escherichia coli K-12. Файл на выходе 3mg1_ecoli.fasta.

    seqret sw:*_ecoli.fasta

  • Индексирование протеома Escherichia coli K-12. Три файла на выходе (ec.phr, ec.pin, ec.psq).

    formatdb -i 3mg1_ecoli.fasta -p T -n ec

• Извлечение из фрагмента трансляции всех открытых рамок считывания длиной не менее 240 нуклеотидов: Использована программа getorf из пакета EMBOSS.

  getorf -minsize 240 -table 11 -find 1

  Параметр -table задает генетический код, в данном случае - стандартный для бактерий (bacterial) генетический код (11). Парaметр -find указывает на то, что именно следует считать открытой рамкой считывания, в данном случае это регион нуклеотидной последовательности, заключенный между старт-кодоном и стоп-кодоном, транслированный в файле на выходе (1), getorfans.orf. Параметр -minsize задает минимальное число нуклеотидов открытой рамки, здесь 240.
  
  

• Создание книги Excel, включающей информацию обо всех открытых рамках считывания во фрагменте генома: Создан список открытых рамок считывания фрагмента - orf_count.txt. с помощью команды

  grep '^>' getorfans.orf

  Далее с помощью импрорта данных создана книга Excel orf.xls.

  ! Создание скрипта для подсчета количества сходных последовательностей, найденных у E. coli при условии E-value<0,001 для каждой ORF

  В соответствии с указаниями был создан скрипт:

  seqret getorfans.orf:AALF01000002_i stdout|blastall -p blastp -d -ec -e 0.001|grep Identities -c > query_count.txt  , i= 1,2,...,15

  Его можно сделать короче, использовав синтаксис для введения переменной (см. script.txt). Скрипт генерирует файл со столбцом посчитанных находок по протеому кишечной палочки для каждой ORF_#, этот столбец путем стандартного импорта данных вносится в книгу Excel orf.xls.
  
  

• Описание взаимного расположения предполагаемых генов в заданном фрагменте:
  

  5`--[=>ген aaaa, 126005-126565]                --[=>ген cccc, 129854-131422]-------------------------------------------------------3`
                    -[=>ген bbbb, 126558-127277]-
  3`--------------------------------------------------------------------------[<=ген dddd, 131486-132160][<=ген eeee, 132160-132999]-5`

  
  Если находок несколько, будем считать, что находка с лучшим E-value соответствует искомому гену. С помощью script1.txt получаем файлы с выравниваниями для каждой ORF. Результаты ненулевые для пяти ORFов:
  
  
  • orf_1.fasta
  • orf_2.fasta
  • orf_5.fasta
  • orf_8.fasta
  • orf_9.fasta
  
  Получаем:
  

  5`--[=>ген dcuS, 126005-126565]                --[=>ген ansP, 129854-131422]-------------------------------------------------------3`
                    -[=>ген dcuR, 126558-127277]-
  3`--------------------------------------------------------------------------[<=ген narJ, 131486-132160][<=ген narI, 132160-132999]-5`

  ! Эффект перекрывания открытых рамок считывания фрагмента генома

  • Первая возможная причина:
    "Минимальное количество генов у бактерии микоплазмы - 470 штук, у дрожжей - 6000, у нематоды - 19000, а у человека около 20000, то есть от нематоды и мухи по количеству генов мы не сильно отличаемся. Количество хромосомной ДНК, приходящейся на один ген у бактерий -1000 п.н. то есть гены упакованы очень плотно; у дрожжей - 2000 п.н., и кое-где гены разделены некоторым пространством; у нематоды - 5000 п.н. на ген и появляются пространства внутри генов - интроны; у человека - 30000 п.н. У нас в геноме большие межгенные пространства и большие пространства внутри генов." (Взято отсюда.) Итак, перекрывание генов в геномах бактерий является способом компактного распределения большого количества генов на небольшой (относительно этого количества) геномной последовательности, экономия места.
    
  • Вторая возможная причина:
    Перекрывание генов, возможно, просходит при совпадении закодированных на участке перекрывания аминокислотных последовательностей кодируемых белков. Однако в данном случае перекрытия генов не наблюдается (всего 7 нуклеотидов), вероятно, это общие нетранслируемые регуляторные участки.
    
    

  • Cравнение взаимного расположения предсказанных генов вo фрагменте и сходных аннотированных генов E. coli.:
    

    5`--[<=ген narJ, 1286716-1287426][<=ген narI, 1287426-1288103]---------------------------------------------------------------------------------------------------3`
                      
    3`-----------------------------------------------------------------------------[<=ген ansP, 1522505-1524004] ------------------[<=ген dcuS, 4348054-4349685]-----5`
                                                                                                                                -[<=ген dcuR, 4347338-4348057]-

    Нетрудно заметить, что произошло зеркальное отображение относительно двух цепей ДНК и расположения генов в геномах. Пара генов narJ-narI, будучи последней во фрагменте, стала первой в геноме кишечной палочки и т.д. Однако говорить именно о зеркальном отражении расположения генов неправильно, ибо заметно, что порядок транслиции генов narJ-narI не поменялся. У бактерий бывает, что группа генов, расположенных вместе, отвечает за группу последовательных этапов метаболизма. Такая группа генов регулируется на уровне транскрипции единым образом и называется оперон. Часто последовательность расположения генов в опероне совпадает с последовательностью метаболических этапов. Сходство, пожалуй, только в расположении пар генов narJ-narI и dcuS-dcuR, это объясняется тем, что эти гены входят в состав оперонов narLXKGHJI и dcuBRS соответственно.