Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.ru/~mikhail88/term4/ec.html
Дата изменения: Wed Mar 28 18:20:20 2007
Дата индексирования: Tue Oct 2 07:29:25 2012
Кодировка: Windows-1251

Главная страница > Четвертый семестр > Коды ферментов

Коды ферментов

Значение кода фермента EC 2.7.9.3

Информация о значении кода фермента EC 2.7.9.3 была получена на сайте IUPAC. Первая цифра кода (2) указывает на то, что фермент является трансферазой, то есть участвует в переносе какой-либо группы с одной молекулы на другую. Вторая (7) и третья (9) цифры кода фермента обозначают переносимую группу и тип акцептора переносимой группы соответственно. В данном случае имеет место перенос фосфата, в качестве акцепторов выступают две молекулы (то есть одновременно фосфорилируются два субстрата). Четвертая цифра обозначает сам фермент (катализируемую реакцию) — селенид, H₂O-дикиназу (selenid, water-dikinase; селенофосфатсинтетаза). Селенофосфатсинтетаза осуществляет перенос двух фосфатных групп ATP на селенид и H₂O с образованием AMP, неорганического фосфата и селенофосфата.

Сравнение последовательностей ферментов с одинаковым кодом из эволюционно далеких организмов

Рассмотрены последовательности селенофосфатсинтетаз (EC 2.7.9.3) из организмов Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens. Последовательности ферментов были получены с помощью следующего запроса SRS:

([uniprot-ECNumber:2.7.9.3] & (([uniprot-ID:*_ecoli] | [uniprot-ID:*_metja]) | [uniprot-ID:*_human]))

Результаты поиска приведены здесь (выбран способ отображения SW_InterProMatches). Были найдены две последовательности селенофосфатсинтетаз человека (кодируются генами SPS1 и SPS2, UniProt ID SPS1_HUMAN и SPS2_HUMAN), по одной последовательности селенофосфатсинтетаз-2 E.coli K-12 и M.jannadchii (кодируются генами selD, UniProt ID SELD_ECOLI и SELD_METJA) и трансляты двух человеческих cDNA (UniProt ID Q8N9T3_HUMAN и Q8NAW0_HUMAN), которые, по-видимому, синтезированы на мРНК Sps2 (см. выравнивание последовательностей Sps2 человека и двух cDNA). Для дальнейшего рассмотрения отобраны первые четыре последовательности.

Все последовательности имеют одинаковую доменную структуру Pfam: содержат N-концевой домен AIRS (PF00586) и C-концевой домен AIRS_C (PF02769). По данным InterPro, в большинстве случаев оба домена входят в состав последовательностей белков одновременно; некотрые бактериальные фосфорибозилформилглицинамидинсинтазы (EC 6.3.5.3, например, из организмов Shewanella sp., Polynucleobacter sp. и Burkholderia cenocepacia) содержат один домен AIRS и два домена AIRS_C. Белки, имеющие данные домены, участвуют в различных ферментативных реакциях, общей чертой которых является гидролиз ATP. При этом может иметь место фосфорилирование таких субстратов, как Se^2- и интермедиаты биосинтеза пуринов: 2-N-формил-1-N-(5-фосфо-D-рибозил)глицинамид, 2-(формамидо)-1-N-(5-фосфо-D-рибозил)ацетамидин и H₂O — ATP-зависимая дегидратация (R-C(O)NH₂ = R-CN + H₂O). При этом домен AIRS предположительно содежит ATP-связывающий центр, функция домена AIRS_C неизвестна. Информация о молекулярном механизме реакций, осуществляемых белками, содержащими домены AIRS и AIRS_C, взята из БД EcoCyc.

Информация о доменной структуре селенофосфатсинтетаз приведена в табл. 2. В связи с тем, что рассматриваемые белки состоят из гомологичных доменов (имеющих одинаковое расположение), их также можно считать гомологичными.

Для оценки попарного сходства гомологичных доменов последовательности белков, найденных с помощью SRS, были сохранены в FASTA-формате. Затем с помощью команды seqret были получены последовательности доменов и проведено их множественное выравнивание с использованием программы muscle (Edgar, 2004). Алгоритм данной программы позволяет получать наиболее точные выравнивания (по сравнению с другими распространенными алгоритмами: T-Coffee и ClustalW), что существенно при выравнивании последовательностей из значительно удаленных друг от друга организмов. Построенные выравнивания приведены здесь (красным отмечены позиции, содержащие четыре одинаковых аминокислотных остатка, зеленым — три, желтым — два).

Измерение попарного сходства (similarity) между последовательностями гомологичных доменов было проведено на основе построенных выравниваний с помощью программы fprotdist (программа запущена с параметром -method s). Выдачи программы для доменов AIRS и AIRS_C приведены на рис. 1 и 2 соответственно (значения попарного сходства были переведены из долей в проценты). Работа с программами была осуществлена с помощью следующего скрипта Linux:

   seqret seld_ecoli.fasta 1_1.fasta -sbegin1 7 -send1 158 -sreverse N
   seqret seld_metja.fasta 1_2.fasta -sbegin1 11 -send1 161 -sreverse N
   seqret sps1_human.fasta 1_3.fasta -sbegin1 32 -send1 188 -sreverse N
   seqret sps2_human.fasta 1_4.fasta -sbegin1 52 -send1 239 -sreverse N
   seqret seld_ecoli.fasta 2_1.fasta -sbegin1 169 -send1 345 -sreverse N
   seqret seld_metja.fasta 2_2.fasta -sbegin1 170 -send1 341 -sreverse N
   seqret sps1_human.fasta 2_3.fasta -sbegin1 192 -send1 368 -sreverse N
   seqret sps2_human.fasta 2_4.fasta -sbegin1 243 -send1 418 -sreverse N
   cat 1_1.fasta > domain_1.fasta
   cat 1_2.fasta >> domain_1.fasta
   cat 1_3.fasta >> domain_1.fasta
   cat 1_4.fasta >> domain_1.fasta
   cat 2_1.fasta > domain_2.fasta
   cat 2_2.fasta >> domain_2.fasta
   cat 2_3.fasta >> domain_2.fasta
   cat 2_4.fasta >> domain_2.fasta
   rm 1_1.fasta
   rm 1_2.fasta
   rm 1_3.fasta
   rm 1_4.fasta
   rm 2_1.fasta
   rm 2_2.fasta
   rm 2_3.fasta
   rm 2_4.fasta
   muscle -in domain_1.fasta -out domain_1_align.msf -msf
   muscle -in domain_2.fasta -out domain_2_align.msf -msf
   fprotdist domain_1_align.msf domain_1.fprotdist -method s -auto
   fprotdist domain_2_align.msf domain_2.fprotdist -method s -auto

Попарное сходство между последовательностями доменов AIRS и AIRS_C белков Sps2 и Sps2 человека составляет 75% и 86% соответственно, тогда как попарное сходство между любыми другими последовательностями не превышает 41%. По результатам Guimarães et al. (1996), как Sps1, так и Sps2 катализируют одну и ту же реакцию, но Sps1 экспрессируется в клетках взрослого организма, а Sps2 — преимущественно на ранних стадиях эмбриогенеза. При этом Sps1 и Sps2 участвуют в различных метаболических путях: синтез селенофосфата из селенита de novo и синтез селенофосфата из селена (в нулевой степени окисления) соответственно, по результатам Tamura et al. (2004). Таким образом, у человека имеется два паралога селенофосфатсинтетазы, которые разошлись значительно позже, чем эукариоты и бактерии и эукариоты и археи.

Несмотря на низкое попарное сходство (до 25% между последовательностями доменов AIRS_C Sps2 человека и SelD E.coli K-12), рассматриваемые ферменты катализируют одну и ту же реакцию. Следовательно, низкое сходство последовательностей белков не означает, что эти белки должны выполнять разные функции. Для выполнения белком его функции большее значение имеет не аминокислотная последовательность, а пространственная структура: белки со значительно отличающимися последовательностями могут иметь сходные пространственные структуры. Кроме того, высокая консервативность характерна для аминокислотных остатков активных центров, непосредственно принимающих участие в катализе (вероятно, группы из нескольких абсолютно консервативных позиций на выравниваниях образуют активные центры ферментов).

Табл. 1. Доменная структура UniProt-белков Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens, имеющих EC 2.7.9.3.

?	UniProt ID	UniProt AC	Имя гена	Первый домен		Второй домен
?	UniProt ID	UniProt AC	Имя гена	Идентификатор Pfam	Положение в последовательности	Идентификатор Pfam	Положение в последовательности
1	SELD_ECOLI	P16456	selD	PF00586	7-158	PF02769	169-345
2	SELD_METJA	P60819	selD	PF00586	11-161	PF02769	170-341
3	SPS1_HUMAN	P49903	SEPHS1 (SPS1, SELD)	PF00586	32-188	PF02769	192-368
4	SPS2_HUMAN	Q99611	SEPHS2 (SPS2)	PF00586	52-239	PF02769	243-418


              SPS1_HUMAN  SPS2_HUMAN  SELD_ECOLI  SELD_METJA   
  SPS1_HUMAN   100.00%      74.52%      31.16%      35.97%
  SPS2_HUMAN    74.52%     100.00%      32.21%      35.76%
  SELD_ECOLI    31.16%      32.21%     100.00%      40.41%
  SELD_METJA    35.97%      35.76%      40.41%     100.00%

Рис. 1. Таблица попарного сходства (table of similarity) доменов AIRS (PF00586) селенофосфатсинтетаз из организмов Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens.


              SELD_ECOLI  SELD_METJA  SPS1_HUMAN  SPS2_HUMAN   
  SELD_ECOLI   100.00%      28.57%      27.22%      24.84%
  SELD_METJA    28.57%     100.00%      36.97%      40.00%
  SPS1_HUMAN    27.22%      36.97%     100.00%      86.36%
  SPS2_HUMAN    24.84%      40.00%      86.36%     100.00%

Рис. 2. Таблица попарного сходства (table of similarity) доменов AIRS_C (PF02769) селенофосфатсинтетаз из организмов Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens.

Использование средств специализированного ресурса BRENDA для характеристики ферментов

Рассмотрены данные БД BRENDA, относящиеся к селенофосфатсинтетазам (EC 2.7.9.3). Схема катализируемой селенофосфатазами реакции приведена на рис. 3 (механизм реакции был установлен на примере селенофосфатсинтетаз E.coli и Haemophilus influenzae). В БД BRENDA описана 71 последовательность ферментов с EC 2.7.9.3 (селенофосфатсинтетаз). Данный фермент присутствует в клетке в виде мономеров (поле Subunit, Kim and Stadtman, 1995). Посттрансляционные модификации селенофосфатсинтетаз не описаны (поле Posttranslational Modification). Болезни, связанные с селенофосфатсинтетазами, также неизвестны (поле Disease). Селенофосфатсинтетаза играет ключевую роль в обеспечении функционирования всех селеноцистеинсодержащих ферментов. Возможно, нарушения, связанные с его функционированием, приводят к гибели на ранних стадиях эмбриогенеза и, таким образом, не проявляться позднее в виде болезней.

Рис. 3. Схема реакции, катализируемой селенофосфатсинтетазами. По данным BRENDA.

Сравнение аннотаций функций ферментов из далеких организмов между собой и с аннотациями UniProt.

Рассмотрены аннотации последовательностей селенофосфатсинтетаз (EC 2.7.9.3) из организмов Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens (UniProt ID SPS1_HUMAN, SPS2_HUMAN, SELD_ECOLI и SELD_METJA). В БД GOA ни с одной из перечисленных записей UniProt, кроме SPS2_HUMAN, не ассоциирован ни один из терминов онтологии Component (внутриклеточная локализация, четвертичная структура), а ассоциированный с SPS2_HUMAN термин GO:0005575 (компонент клетки, cellular component) не имеет надежных подтверждений (код подтверждения ND). Таким образом, локализация селенофосфатсинтетаз в клетке практически не изучена. С записями SPS1_HUMAN и SPS2_HUMAN (в отличие от SELD_ECOLI и SELD_METJA) ассоциировано по одному термину онтологии Process (процесс): GO:0006464 (модифицирование белков, protein modification, код подтверждения TAS) и GO:0016260 (биосинтез селеноцистеина, selenocysteine biosynthetic process, код подтверждения NAS) соответственно. По результатам Low et al. (1995), Sps1 человека принимает участие в синтезе селеноцистеил-tRNA^Sec, поставляя необходимый для этого интермедиат — селенофосфат (ссылка на статью приведена в аннотации GOA). Селеноцистеил-tRNA^Sec участвует в биосинтезе селеноцистеинсодержащих белков (например, глутатионпероксидазы). Таким образом, Sps1 также принимает участие в биосинтезе селеноцистеина, однако запись SPS1_HUMAN не ассоциирована с термином биосинтез селеноцистеина. Аналогично Sps2, как и Sps1, поставляет селенофосфат для биосинтеза селеносодержащих белков, однако запись SPS2_HUMAN не ассоциирована с термином модифицирование белков. Оба термина имеют коды подтверждения, указывающие на то, что они были присвоены куратором (NAS и TAS). Возможно, различия аннотаций записей SPS1_HUMAN и SPS2_HUMAN связаны с тем, что аннотация осуществлялась независимо двумя разными кураторами.

С каждой из записей UniProt ассоциировано не менее шести терминов онтологии Function (молекулярный механизм и специфичность). Большинство из терминов имеют коды подтверждения IEA, то есть были присвоены на основе поиска сходных последовательностей с известной функцией. Экспериментальное подтверждения имеют только термины, указывающие на способность Sps1 связывать ATP и ADP (Low et al., 1995) и на способность Sps2 осуществлять рекцию ATP + селенид + H2O = AMP + селенофосфат + P_i (Guimarães et al., 1996). Набор терминов GOA онтологии Function для каждой из записей UniProt совпадает, за исключением термина GO:0000287 (связывание ионов Mg²⁺, magnesium ion binding), ассоциированного только с прокариотическими записями, и GO:0005525 (связывание GTP, GTP binding), ассоциированного только с SPS1_ECOLI. По данным HAMAP, ион Mg²⁺ является кофактором селенофосфатсинтетазы. Отсутствие ассоциаций эукариотических записей UniProt с термином связывание ионов Mg²⁺ обусловлено тем, что данный термин был ассоциирован с прокариотическими записями на основе информации БД HAMAP, содержащей аннотации только прокариотических семейств белков и семейств белков пластид. Другие термины онтологии Function, ассоциированные с рассматриваемыми записями UniProt, указывают на способность селенофосфатсинтетаз связывать ATP (GO:0005524), связывать селен (GO:0008430) и катализировать реакцию ATP + селенид + H2O = AMP + селенофосфат + P_i (GO:0004756), или являются родительскими по отношению к данным терминам.

Аннотации прокариотических записей UniProt (UniProt ID SELD_ECOLI и SELD_METJA) практически совпадают с аннотациями GOA. Это связано с тем, что они были импортированы из одного источника (HAMAP) в обе БД. Единственным отличием является то, что в аннотациях GOA приведены некоторые родительские термины для терминов HAMAP, а в UniProt — нет. При этом все родительские термины были импортированы из других БД, в которых приведена менее подробная информация, чем в HAMAP (для ассоциирования терминов с записями UniProt GOA использует большее количество источников информации, чем UniProt). Аннотации UniProt эукариотических записей (UniProt ID SPS1_HUMAN и SPS2_HUMAN) менее подробны, чем аннотации GOA. Например, для Sps2 человека не указана способность связывать ATP и участие в биосинтезе селеноцистеина. Таким образом, аннотирование записей в UniProt отстает от аннотирования записей в GOA (GOA является специализированной БД, содержащей только аннотации, БД UniProt в первую очередь предназначена для хранения аминокислотных последовательностей).

Использование средств специализированного ресурса BRENDA для сравнения свойств двух ферментов из далеких организмов

Проведено сравнение свойств селенофосфатсинтетаз (EC 2.7.9.3) из организмов E.coli K-12 и Homo sapiens. Для этого была осуществлена фильтрация всех записей BRENDA, относящихся к селенофосфатсинтетазам, по принадлежности к данным организмам. Для селенофосфатсинтетазы E.coli, в отличие от селенофосфатсинтетаз человека, известно оптимальное значение pH (7.2). Единственным известным ингибитором селенофосфатсинтетаз человека является 8-азидо-ATP (конкурентный механизм ингибирования, рис. 4). Данный ингибитор, содержащий ³²P, был использован для мечения селенофосфатсинтетазы-1 в работе Low et al. (1995). Было показано, что данное вещество, как и другие искусственные аналоги ATP (α, β-метилен-ATP и γ-тио-ATP) и АМP являются ингибитором селенофосфатсинтетазы E.coli (Veres et al., 1994). Кроме того, селенофосфатсинтетазу E.coli ингибируют H₂O₂ и различные неорганические ионы (Li⁺ и Na⁺ в присутствии K⁺, Zn²⁺ — конкурентно по отношению к кофактору селенофосфатсинтетазы Mg²⁺, фосфат и селенофосфат — продукты катализируемой реакции, смещающие равновесие влево). Возможно, данные ингибиторы действуют и на селенофосфатдегидрогеназы человека, что не было проверено экспериментально (большая изученность селенофосфатсинтетазы E.coli по сравнению с селенофосфатсинтетазой человека, скорее всего, связана с возможностью выделения в больших количествах). Активаторы селенофосфатдегидрогеназ неизвестны.

Рис. 4. 8-азидо-ATP, конкурентный ингибитор селенофосфатсинтетазы. По данным BRENDA.

^ї Куравский Михаил Львович, 2007