Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес
оригинального документа
: http://kodomo.cmm.msu.ru/~mikhail88/term4/ec.html
Дата изменения: Wed Mar 28 18:20:20 2007 Дата индексирования: Tue Oct 2 07:29:25 2012 Кодировка: Windows-1251 |
Главная страница > Четвертый семестр > Коды ферментов
Информация о значении кода фермента EC 2.7.9.3 была получена на сайте IUPAC. Первая цифра кода (2) указывает на то, что фермент является трансферазой, то есть участвует в переносе какой-либо группы с одной молекулы на другую. Вторая (7) и третья (9) цифры кода фермента обозначают переносимую группу и тип акцептора переносимой группы соответственно. В данном случае имеет место перенос фосфата, в качестве акцепторов выступают две молекулы (то есть одновременно фосфорилируются два субстрата). Четвертая цифра обозначает сам фермент (катализируемую реакцию) селенид, H2O-дикиназу (selenid, water-dikinase; селенофосфатсинтетаза). Селенофосфатсинтетаза осуществляет перенос двух фосфатных групп ATP на селенид и H2O с образованием AMP, неорганического фосфата и селенофосфата.
Рассмотрены последовательности селенофосфатсинтетаз (EC 2.7.9.3) из организмов Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens. Последовательности ферментов были получены с помощью следующего запроса SRS:
([uniprot-ECNumber:2.7.9.3] & (([uniprot-ID:*_ecoli] | [uniprot-ID:*_metja]) | [uniprot-ID:*_human]))
Результаты поиска приведены здесь (выбран способ отображения SW_InterProMatches). Были найдены две последовательности селенофосфатсинтетаз человека (кодируются генами SPS1 и SPS2, UniProt ID SPS1_HUMAN и SPS2_HUMAN), по одной последовательности селенофосфатсинтетаз-2 E.coli K-12 и M.jannadchii (кодируются генами selD, UniProt ID SELD_ECOLI и SELD_METJA) и трансляты двух человеческих cDNA (UniProt ID Q8N9T3_HUMAN и Q8NAW0_HUMAN), которые, по-видимому, синтезированы на мРНК Sps2 (см. выравнивание последовательностей Sps2 человека и двух cDNA). Для дальнейшего рассмотрения отобраны первые четыре последовательности.
Все последовательности имеют одинаковую доменную структуру Pfam: содержат N-концевой домен AIRS (PF00586) и C-концевой домен AIRS_C (PF02769). По данным InterPro, в большинстве случаев оба домена входят в состав последовательностей белков одновременно; некотрые бактериальные фосфорибозилформилглицинамидинсинтазы (EC 6.3.5.3, например, из организмов Shewanella sp., Polynucleobacter sp. и Burkholderia cenocepacia) содержат один домен AIRS и два домена AIRS_C. Белки, имеющие данные домены, участвуют в различных ферментативных реакциях, общей чертой которых является гидролиз ATP. При этом может иметь место фосфорилирование таких субстратов, как Se2- и интермедиаты биосинтеза пуринов: 2-N-формил-1-N-(5-фосфо-D-рибозил)глицинамид, 2-(формамидо)-1-N-(5-фосфо-D-рибозил)ацетамидин и H2O ATP-зависимая дегидратация (R-C(O)NH2 = R-CN + H2O). При этом домен AIRS предположительно содежит ATP-связывающий центр, функция домена AIRS_C неизвестна. Информация о молекулярном механизме реакций, осуществляемых белками, содержащими домены AIRS и AIRS_C, взята из БД EcoCyc.
Информация о доменной структуре селенофосфатсинтетаз приведена в табл. 2. В связи с тем, что рассматриваемые белки состоят из гомологичных доменов (имеющих одинаковое расположение), их также можно считать гомологичными.
Для оценки попарного сходства гомологичных доменов последовательности белков, найденных с помощью SRS, были сохранены в FASTA-формате. Затем с помощью команды seqret были получены последовательности доменов и проведено их множественное выравнивание с использованием программы muscle (Edgar, 2004). Алгоритм данной программы позволяет получать наиболее точные выравнивания (по сравнению с другими распространенными алгоритмами: T-Coffee и ClustalW), что существенно при выравнивании последовательностей из значительно удаленных друг от друга организмов. Построенные выравнивания приведены здесь (красным отмечены позиции, содержащие четыре одинаковых аминокислотных остатка, зеленым три, желтым два).
Измерение попарного сходства (similarity) между последовательностями гомологичных доменов было проведено на основе построенных выравниваний с помощью программы fprotdist (программа запущена с параметром -method s). Выдачи программы для доменов AIRS и AIRS_C приведены на рис. 1 и 2 соответственно (значения попарного сходства были переведены из долей в проценты). Работа с программами была осуществлена с помощью следующего скрипта Linux:
seqret seld_ecoli.fasta 1_1.fasta -sbegin1 7 -send1 158 -sreverse N
seqret seld_metja.fasta 1_2.fasta -sbegin1 11 -send1 161 -sreverse N
seqret sps1_human.fasta 1_3.fasta -sbegin1 32 -send1 188 -sreverse N
seqret sps2_human.fasta 1_4.fasta -sbegin1 52 -send1 239 -sreverse N
seqret seld_ecoli.fasta 2_1.fasta -sbegin1 169 -send1 345 -sreverse N
seqret seld_metja.fasta 2_2.fasta -sbegin1 170 -send1 341 -sreverse N
seqret sps1_human.fasta 2_3.fasta -sbegin1 192 -send1 368 -sreverse N
seqret sps2_human.fasta 2_4.fasta -sbegin1 243 -send1 418 -sreverse N
cat 1_1.fasta > domain_1.fasta
cat 1_2.fasta >> domain_1.fasta
cat 1_3.fasta >> domain_1.fasta
cat 1_4.fasta >> domain_1.fasta
cat 2_1.fasta > domain_2.fasta
cat 2_2.fasta >> domain_2.fasta
cat 2_3.fasta >> domain_2.fasta
cat 2_4.fasta >> domain_2.fasta
rm 1_1.fasta
rm 1_2.fasta
rm 1_3.fasta
rm 1_4.fasta
rm 2_1.fasta
rm 2_2.fasta
rm 2_3.fasta
rm 2_4.fasta
muscle -in domain_1.fasta -out domain_1_align.msf -msf
muscle -in domain_2.fasta -out domain_2_align.msf -msf
fprotdist domain_1_align.msf domain_1.fprotdist -method s -auto
fprotdist domain_2_align.msf domain_2.fprotdist -method s -auto
Попарное сходство между последовательностями доменов AIRS и AIRS_C белков Sps2 и Sps2 человека составляет 75% и 86% соответственно, тогда как попарное сходство между любыми другими последовательностями не превышает 41%. По результатам Guimarães et al. (1996), как Sps1, так и Sps2 катализируют одну и ту же реакцию, но Sps1 экспрессируется в клетках взрослого организма, а Sps2 преимущественно на ранних стадиях эмбриогенеза. При этом Sps1 и Sps2 участвуют в различных метаболических путях: синтез селенофосфата из селенита de novo и синтез селенофосфата из селена (в нулевой степени окисления) соответственно, по результатам Tamura et al. (2004). Таким образом, у человека имеется два паралога селенофосфатсинтетазы, которые разошлись значительно позже, чем эукариоты и бактерии и эукариоты и археи.
Несмотря на низкое попарное сходство (до 25% между последовательностями доменов AIRS_C Sps2 человека и SelD E.coli K-12), рассматриваемые ферменты катализируют одну и ту же реакцию. Следовательно, низкое сходство последовательностей белков не означает, что эти белки должны выполнять разные функции. Для выполнения белком его функции большее значение имеет не аминокислотная последовательность, а пространственная структура: белки со значительно отличающимися последовательностями могут иметь сходные пространственные структуры. Кроме того, высокая консервативность характерна для аминокислотных остатков активных центров, непосредственно принимающих участие в катализе (вероятно, группы из нескольких абсолютно консервативных позиций на выравниваниях образуют активные центры ферментов).
Табл. 1. Доменная структура UniProt-белков Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens, имеющих EC 2.7.9.3.
? | UniProt ID | UniProt AC | Имя гена | Первый домен | Второй домен | ||
Идентификатор Pfam | Положение в последовательности | Идентификатор Pfam | Положение в последовательности | ||||
1 | SELD_ECOLI | P16456 | selD | PF00586 | 7-158 | PF02769 | 169-345 |
2 | SELD_METJA | P60819 | selD | PF00586 | 11-161 | PF02769 | 170-341 |
3 | SPS1_HUMAN | P49903 | SEPHS1 (SPS1, SELD) | PF00586 | 32-188 | PF02769 | 192-368 |
4 | SPS2_HUMAN | Q99611 | SEPHS2 (SPS2) | PF00586 | 52-239 | PF02769 | 243-418 |
SPS1_HUMAN SPS2_HUMAN SELD_ECOLI SELD_METJA SPS1_HUMAN 100.00% 74.52% 31.16% 35.97% SPS2_HUMAN 74.52% 100.00% 32.21% 35.76% SELD_ECOLI 31.16% 32.21% 100.00% 40.41% SELD_METJA 35.97% 35.76% 40.41% 100.00% |
Рис. 1. Таблица попарного сходства (table of similarity) доменов AIRS (PF00586) селенофосфатсинтетаз из организмов Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens.
SELD_ECOLI SELD_METJA SPS1_HUMAN SPS2_HUMAN SELD_ECOLI 100.00% 28.57% 27.22% 24.84% SELD_METJA 28.57% 100.00% 36.97% 40.00% SPS1_HUMAN 27.22% 36.97% 100.00% 86.36% SPS2_HUMAN 24.84% 40.00% 86.36% 100.00% |
Рис. 2. Таблица попарного сходства (table of similarity) доменов AIRS_C (PF02769) селенофосфатсинтетаз из организмов Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens.
Рассмотрены данные БД BRENDA, относящиеся к селенофосфатсинтетазам (EC 2.7.9.3). Схема катализируемой селенофосфатазами реакции приведена на рис. 3 (механизм реакции был установлен на примере селенофосфатсинтетаз E.coli и Haemophilus influenzae). В БД BRENDA описана 71 последовательность ферментов с EC 2.7.9.3 (селенофосфатсинтетаз). Данный фермент присутствует в клетке в виде мономеров (поле Subunit, Kim and Stadtman, 1995). Посттрансляционные модификации селенофосфатсинтетаз не описаны (поле Posttranslational Modification). Болезни, связанные с селенофосфатсинтетазами, также неизвестны (поле Disease). Селенофосфатсинтетаза играет ключевую роль в обеспечении функционирования всех селеноцистеинсодержащих ферментов. Возможно, нарушения, связанные с его функционированием, приводят к гибели на ранних стадиях эмбриогенеза и, таким образом, не проявляться позднее в виде болезней.
Рис. 3. Схема реакции, катализируемой селенофосфатсинтетазами. По данным BRENDA.
Рассмотрены аннотации последовательностей селенофосфатсинтетаз (EC 2.7.9.3) из организмов Escherichia coli K-12, Methanococcus jannaschii и Homo sapiens (UniProt ID SPS1_HUMAN, SPS2_HUMAN, SELD_ECOLI и SELD_METJA). В БД GOA ни с одной из перечисленных записей UniProt, кроме SPS2_HUMAN, не ассоциирован ни один из терминов онтологии Component (внутриклеточная локализация, четвертичная структура), а ассоциированный с SPS2_HUMAN термин GO:0005575 (компонент клетки, cellular component) не имеет надежных подтверждений (код подтверждения ND). Таким образом, локализация селенофосфатсинтетаз в клетке практически не изучена. С записями SPS1_HUMAN и SPS2_HUMAN (в отличие от SELD_ECOLI и SELD_METJA) ассоциировано по одному термину онтологии Process (процесс): GO:0006464 (модифицирование белков, protein modification, код подтверждения TAS) и GO:0016260 (биосинтез селеноцистеина, selenocysteine biosynthetic process, код подтверждения NAS) соответственно. По результатам Low et al. (1995), Sps1 человека принимает участие в синтезе селеноцистеил-tRNASec, поставляя необходимый для этого интермедиат селенофосфат (ссылка на статью приведена в аннотации GOA). Селеноцистеил-tRNASec участвует в биосинтезе селеноцистеинсодержащих белков (например, глутатионпероксидазы). Таким образом, Sps1 также принимает участие в биосинтезе селеноцистеина, однако запись SPS1_HUMAN не ассоциирована с термином биосинтез селеноцистеина. Аналогично Sps2, как и Sps1, поставляет селенофосфат для биосинтеза селеносодержащих белков, однако запись SPS2_HUMAN не ассоциирована с термином модифицирование белков. Оба термина имеют коды подтверждения, указывающие на то, что они были присвоены куратором (NAS и TAS). Возможно, различия аннотаций записей SPS1_HUMAN и SPS2_HUMAN связаны с тем, что аннотация осуществлялась независимо двумя разными кураторами.
С каждой из записей UniProt ассоциировано не менее шести терминов онтологии Function (молекулярный механизм и специфичность). Большинство из терминов имеют коды подтверждения IEA, то есть были присвоены на основе поиска сходных последовательностей с известной функцией. Экспериментальное подтверждения имеют только термины, указывающие на способность Sps1 связывать ATP и ADP (Low et al., 1995) и на способность Sps2 осуществлять рекцию ATP + селенид + H2O = AMP + селенофосфат + Pi (Guimarães et al., 1996). Набор терминов GOA онтологии Function для каждой из записей UniProt совпадает, за исключением термина GO:0000287 (связывание ионов Mg2+, magnesium ion binding), ассоциированного только с прокариотическими записями, и GO:0005525 (связывание GTP, GTP binding), ассоциированного только с SPS1_ECOLI. По данным HAMAP, ион Mg2+ является кофактором селенофосфатсинтетазы. Отсутствие ассоциаций эукариотических записей UniProt с термином связывание ионов Mg2+ обусловлено тем, что данный термин был ассоциирован с прокариотическими записями на основе информации БД HAMAP, содержащей аннотации только прокариотических семейств белков и семейств белков пластид. Другие термины онтологии Function, ассоциированные с рассматриваемыми записями UniProt, указывают на способность селенофосфатсинтетаз связывать ATP (GO:0005524), связывать селен (GO:0008430) и катализировать реакцию ATP + селенид + H2O = AMP + селенофосфат + Pi (GO:0004756), или являются родительскими по отношению к данным терминам.
Аннотации прокариотических записей UniProt (UniProt ID SELD_ECOLI и SELD_METJA) практически совпадают с аннотациями GOA. Это связано с тем, что они были импортированы из одного источника (HAMAP) в обе БД. Единственным отличием является то, что в аннотациях GOA приведены некоторые родительские термины для терминов HAMAP, а в UniProt нет. При этом все родительские термины были импортированы из других БД, в которых приведена менее подробная информация, чем в HAMAP (для ассоциирования терминов с записями UniProt GOA использует большее количество источников информации, чем UniProt). Аннотации UniProt эукариотических записей (UniProt ID SPS1_HUMAN и SPS2_HUMAN) менее подробны, чем аннотации GOA. Например, для Sps2 человека не указана способность связывать ATP и участие в биосинтезе селеноцистеина. Таким образом, аннотирование записей в UniProt отстает от аннотирования записей в GOA (GOA является специализированной БД, содержащей только аннотации, БД UniProt в первую очередь предназначена для хранения аминокислотных последовательностей).
Проведено сравнение свойств селенофосфатсинтетаз (EC 2.7.9.3) из организмов E.coli K-12 и Homo sapiens. Для этого была осуществлена фильтрация всех записей BRENDA, относящихся к селенофосфатсинтетазам, по принадлежности к данным организмам. Для селенофосфатсинтетазы E.coli, в отличие от селенофосфатсинтетаз человека, известно оптимальное значение pH (7.2). Единственным известным ингибитором селенофосфатсинтетаз человека является 8-азидо-ATP (конкурентный механизм ингибирования, рис. 4). Данный ингибитор, содержащий 32P, был использован для мечения селенофосфатсинтетазы-1 в работе Low et al. (1995). Было показано, что данное вещество, как и другие искусственные аналоги ATP (α, β-метилен-ATP и γ-тио-ATP) и АМP являются ингибитором селенофосфатсинтетазы E.coli (Veres et al., 1994). Кроме того, селенофосфатсинтетазу E.coli ингибируют H2O2 и различные неорганические ионы (Li+ и Na+ в присутствии K+, Zn2+ конкурентно по отношению к кофактору селенофосфатсинтетазы Mg2+, фосфат и селенофосфат продукты катализируемой реакции, смещающие равновесие влево). Возможно, данные ингибиторы действуют и на селенофосфатдегидрогеназы человека, что не было проверено экспериментально (большая изученность селенофосфатсинтетазы E.coli по сравнению с селенофосфатсинтетазой человека, скорее всего, связана с возможностью выделения в больших количествах). Активаторы селенофосфатдегидрогеназ неизвестны.
Рис. 4. 8-азидо-ATP, конкурентный ингибитор селенофосфатсинтетазы. По данным BRENDA.
ї Куравский Михаил Львович, 2007