Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.ru/~maravilla/term3/blastcont.html
Дата изменения: Sat Feb 13 17:17:12 2010
Дата индексирования: Tue Oct 2 12:56:23 2012
Кодировка: Windows-1251

Task 9 (EMBL&BLAST)

Программы пакета BLAST (продолжение)

Работа с программой getorf пакета EMBOSS

Нужно запустить программу "getorf" так, чтобы получить набор трансляций всех открытых рамок данной последовательности длиной более 30 нуклеотидов, считая открытой рамкой последовательность триплетов, начинающуюся со старт-кодона и заканчивающуюся стоп-кодоном, при использовании бактериального кода.
Работаем с полученной записью D89965 банка EMBL.
getorf -minsize 30 -find 1 -table 11 Finds and extracts open reading frames (ORFs) Input nucleotide sequence(s): d89965.entret protein output sequence(s) [d89965.orf]: d89965.orf

Таким образом получили файл d89965.orf
Из найденный открытых рамок соответствует приведенной в записи CDS пятая рамка. Тринадцатая рамка соответствует записи P0A7B8 SwissProt.

Поиск некодирующих последовательностей программой BLASTN

В файле trna_ecoli.fasta лежат последовательности всех тРНК, проаннотированных в полном геноме E.coli K12. Наша задача - определить, сколько гомологов каждой из тРНК находит программа BLASTN в геноме родственной бактерии Pasteurella multocida.
Для этого при помощи программы BLASTN найдем сходные последовательности в заданном геноме:
blastall -p blastn -d index -i trna_ecoli.fasta -m 8 > rna.txt
Полученный файл - rna.txt
C помощью программы "grep" найдем число находок для каждой последовательности тРНК из E.coli. Для этого создадим скрипт names.scr и получим список этих тРНК в файле names.txt . Скопируем их в таблицу Excel.
Затем создадим скрипт script.scr и получим число находок для каждой последовательности ( count.txt ). Результат работы скрипта импортируем в Excel.
Повторим поиск, на этот раз указав порог на E-value 0.001. Полученный файл - count2.txt Добавим в отчетную таблицу соответствующий столбец.

Поиск некодирующих последовательностей программой megablast

Повторим предыдущее задание, используя вместо BLASTN megablast. Для этого введем команду:
megablast -d index -i trna_ecoli.fasta -m 8 > megablast.txt
Полученный файл - megablast.txt .
Discontigous megablast:
megablast -d index -i trna_ecoli.fasta -m 8 -t 16 -W 11 -N 1 > megablast_d.txt
Полученный файл - megablast_d.txt .
Для discontigous megablast дополнительно указываем следующие значения опций:
-t - длина слова из тРНК, которые будут искаться в геноме (может равняться 16, 18 либо 21, мы выберем 16);
-W - длина слова из генома бактерии, по которым идет поиск последовательности (может равняться 11 или 12, выбираем 11);
-N - задает тип разрывов в матрице (может принимать значения 0, 1, 2, мы выберем 1, так как поиск ведется по некодирующим последовательностям).
Результаты внесем в таблицу.
В итоге получилась таблица rna.xls .

Анализ результатов

Выберем тРНК glyW (запись AE006138), которую нашел BLASTN и не нашел megablast. Длина - 10908-10983, цепь прямая.
Вырежем гомологичный участок в отдельный файл командой "seqret -sask". Выделим исходную последовательность также в отдельный файл. Теперь выровняем получившиеся две последовательности ( glyw.fasta и ae006138.fasta ) программой needle. Получили файл result.needle :
# Aligned_sequences: 2 # 1: glyW # 2: AE006138 # Matrix: EDNAFULL # Gap_penalty: 10.0 # Extend_penalty: 0.5 # # Length: 76 # Identity: 73/76 (96.1%) # Similarity: 73/76 (96.1%) # Gaps: 0/76 ( 0.0%) # Score: 353.0 # # #======================================= glyW 1 gcgggaatagctcagttggtagagcacgaccttgccaaggtcggggtcgc 50 |||||||||||||||||||||||||||.|||||||||||||.|||||||| AE006138 1 gcgggaatagctcagttggtagagcacaaccttgccaaggttggggtcgc 50 glyW 51 gagttcgagtctcgtttcccgctcca 76 |||||||||.|||||||||||||||| AE006138 51 gagttcgagcctcgtttcccgctcca 76

Как видно из выравнивания, последовательности практически идентичны (велик процент сходства и мало гэпов). С большой долей вероятности можно утверждать, что это выравнивание является биологически осмысленным.
Эта последовательность была найдена BLASTN и пропущена megablast, так как в ней нет полностью совпадающих участков длины 28, а megablast как раз ищет слова длиной 28. Таким образом, megablast не стоит использовать для коротких последовательностей, как, например, эта.
Так проаннотирован гомологичный участок в записи EMBL, описывающей геном бактерии (AC AE004439):
FT gene 1059689..1060003 FT /locus_tag="PM0901" FT CDS 1059689..1060003 FT /codon_start=1 FT /transl_table=11 FT /locus_tag="PM0901" FT /product="unknown" FT /db_xref="GOA:Q9CMD0" FT /db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:Q9CMD0" FT /protein_id="AAK02985.1" FT /translation="MSIIQAISIFFTFYTCTLAFFSYNVRLSLLNSEKYYAGIAQLVEH FT NLAKVGVASSSLVSRSNISTNQYHILRGNSSVGRAQPCQGWGREFEPRFPLQIFLSNLK FT "

На главную