А. Ю. Кузнецова
Тьюторы: Андрей Владимирович Алексеевский
Сергей Александрович Спирин
Московский государственный университет им. Ломоносова, 2004 год

Введение:
Типичными представителями гомеобелков являются изученные в данной работе TALE-белки. Гомеобелки - это большой класс белков, в составе структур которых есть гомеодомен. Гомеобелки известны с середины 80-х годов, обнаружены у эукариотических организмов, и практически все изученные гомеобелки имеют многодоменную структуру, в некоторых из них функция связывания с ДНК осуществляется при помощи нескольких доменов[1]. Одним из наиболее консервативных ДНК-связывающихся доменов в белках, по численности уступающим только одному классу доменов - цинковым пальцам, является гомеодомен, получивший свое название от кодирующей его нуклеотидной последовательности - гомеобокса, которая была обнаружена в гомеозисных генах плодовой мушки Drosophila melanogaster[3]. При дальнейшем изучении было выявлено, что для гомеобоксов характерна неоднократная представленность в геноме, например, у Caenorabditis elegans число гомеобокс-генов равно около 90, а у D. melanogaster это число превышает 100. Типичные гомеобоксы, состоящие как правило из 180 нуклеотидов, кодируют последовательность, состоящую из 60 аминокислотных остатков. В настоящее время в гомеобелках известно три вида структурных мотива связывания с ДНК: "лейциновая застежка", мотив "спираль-поворот-спираль"(helix-turn-helix) и смешанный мотив, в котором представлены оба предыдущих типа. Гомеодомены, как и все принадлежащие к довольно неоднородному классу НТН-содержащих доменов, используют при контакте с ДНК мотив helix-turn-helix. Отличительной чертой этого мотива является специфическая ориентация узнающей спирали относительно ДНК: эта спираль укладывается в большую бороздку двойной спирали ДНК и связывается с определенной нуклеотидной последовательностью. В белке гомеодомены расположены вблизи С-конца. При помощи методов ядерно-магнитного резонанса и рентгеноструктурной кристаллографии был определен состав гомеодомена: это неструктурированный N-концевой участок (так называемая "рука"), функцией которого является соединение с предыдущим доменом и контакт с малой бороздкой ДНК, и три альфа-спирали, образующие компактную глобулу, третья из которых является узнающей. По особенностям своей первичной, вторичной и третичной структуры гомеодомены выделяются как довольно высококонсервативные в пределах класса белков, использующих при контакте с ДНК НТН_мотив, поэтому при выравнивании аминокислотных последовательностей, используя стандартные программы множественного выравнивания, не возникает затруднений. По своей природе гомеобелки являются очень важными для развития эукариот факторами транскрипции, выполняющими регуляторную функцию. В их число входят активаторы, эффекторы, репрессоры транскрипции, а также белки, выполняющие более комплексные функции, например, некоторые гомеобелки выполняют одновременно обе роли: и репрессора и активатора. При этом in vivo образуются многокомпонентные комплексы, состоящие из гомеобелков в комплексе с другими транскрипционными факторами. В таком случае значительно повышается специфичность связывания и сродство к ДНК. В настоящее время авторы выделяют довольно много, от 8 до 25 классов гомеодоменов, поэтому было предложено два основных критерия их классификации: по сходству аминокислотных последовательностей различных гомеодоменов и по доменному составу гомеобелков. В данной работе главным критерием выступает первый из них. При выравнивании последовательностей и изучении пространственной структуры гомеодоменов нередко выявляется наличие большего или меньшего числа остатков, чем в типичных гомеодоменах, и как правило, это является необходимым и достаточным условием включения определенной выборки в отдельную систематическую группу (класс, семейство). При изучении структуры таких "атипичных" белков ученые обнаружили, что нередко между 1 и 2 или 2 и 3 альфа-спиралями могут находиться дополнительные аминокислотные остатки. Таким образом были выделены в отдельную группу рассматриваемые в данной работе гомеодомены надсемейства TALE. Гомеодомены надсемейства TALE характеризуются наличием трех дополнительных аминокислотных остатков между первой и второй альфа-спиралями, отсюда их название- Three Amino acid Loop Extension.[2] (рис.1)Эти три остатка являются очень высоко консервативными: во всех белках надсемейства TALE на этих позициях находятся пролин - тирозин - пролин (кроме группы TGIF, у которой первой аминокислотой из вставки является аланин). Следующими аминокислотными остатками являются, как правило, серин или треонин. Особенности надсемейства: У типичных гомеодоменов остатки на позициях 16 и 20 являются высококонсервативными (это лейцин, треонин или фенилаланин), но в случае TALE наблюдается другая ситуация: на позиции 16 могут находиться лейцин, фенилаланин, метионин, даже цистеин или серин, а на позиции 20 может быть лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан. Другая особенность связана со специфическим контактом 50 остатка третьей спирали с ДНК (рис. 2). У большинства гомеодоменов на этой позиции находятся полярные аминокислотные остатки (глутамин, лизин, цистеин, гистидин, серин). У представителей надсемейства TALE в большинстве случаев на этой позиции находится неполярный, с небольшим радикалом остаток, который не образует очень прочного контакта с ДНК, и природа контакта может быть различна (см. табл.1). Помимо формирования гидрофобного ядра и удерживания определенной пространственной конформации гомеодомена, главной функцией этих остатков является взаимодействие с гомеодоменом, принадлежащим другому семейству, в комплексе с которым гомеодомены TALE контактируют с ДНК. При этом существенно возрастает специфичность и сродство связывания с ДНК, по сравнению с теми же значениями этих параметров при изолированных доменах. Характеристические различия между типичными гомеодоменами и гомеодоменами надсемейства TALE указывают на довольно большую удаленность этой группы от типичных гомеодоменов.
Рис. 1. Вставка из трех аминокислотных остатков в гомеобелках надсемейства TALE. pdb-структура 1puf, на рисунке оранжевым цветом обозначена цепь ДНК, серым - гомеобелок TALE

Рис.2. Контакт 50 остатка с цепью ДНК с образованием "водяных мостиков". Оранжевым обозначена цепь ДНК, серым - TALE-белок, розовым - аминокислотный остаток глицин, голубым - молекула воды.
Материалы и методы
Посредством базы данных Uniprot/SwissProt, релиз 27 марта 2004 года, было найдено 83 последовательности TALE- белков. Поиск был произведен по ключевому слову: TALE. После ревизии полноразмерных последовательностей была удалена последовательность с AC: Р78412 по причине нахождения при поиске не полноразмерной последовательности, а лишь ее фрагмента. При помощи редактора выравниваний Genedoc было произведено выравнивание вручную. Построено выравнивание всех отобранных последовательностей с помощью программы ClustalW на сервере Genebee. С помощью программы Genedoc производилось определение абсолютно консервативных позиций (100% случаев совпадений), консервативных (не менее 95% совпадений), абсолютно функционально консервативных (родственные а.о. по физико-химическим свойствам в 100% случаев) и функционально консервативных (не менее 95% совпадений) позиций. Для функциональной аннотации консервативных позиций использована структура гомеобелка с pdb 1puf.ent. Используя программу Rasmol, найдены а.о., взаимодействующие с ДНК (критерий взаимодействия: расстояние до ДНК при образовании водородных связей не более 3,5A), были определены консервативные аминокислотные остатки, взаимодействующие с другим гомеодоменом. Программой CluD (http://math.belozersky.msu.ru/~mlt/HF_page.html) найдены а.о., участвующие в образовании гидрофобного ядра доменов. Остальные аминокислотные остатки были аннотированы при помощи программы Rasmol.

Паттерн для надсемейства TALE: X-{K,R}-X-{K,R,Y,C}-{R,K,A,P}-X(4)-{K,G,R,D,P}-X{5}-{L,M,C}-X(2)-{Y,W,H}-X(3)-{H,T,N}-X(3)-{P,A}-Y-{P,L}-{T,S,D}-{E,K,Q}-X-{E,Q,D,A,G}-{K,R,F,L}-X(2)-{L,I}-{A,V,S}-X(2)-{T,C,A}-X-{I,L,M}-X-{T,V,L,P,Q,I,R}- X -{Q,H,D}-{I,L,V}-X-{N,T,L,R,A}-W-{F,V}-{I,G,A,S}-{N,D,A}-X-R-{R,I,A,K}-{R,K}-X(5)

Рис.3. Водородная связь между серином (27 позиция) и аланином (30 позиция). Оранжевым обозначена цепь ДНК, серым - TALE-белок, фиолетовым -аминокислотный остаток серин, желтым - аминокислотный остаток аланин.
Список использованной литературы.
[1] Леднева Р.К. и др. Структурные аспекты взаимодействия гомеодоменов с ДНК, Молекулярная биология т.35 (2001).
[2] Thomas R. Burglin. Analysis of TALE superclass homeobox genes (MEIS, PBC, KNOX, Iroquois, TGIF)reveals a novel domain conserved between plants and animals.
[3] К.В. Фоминых. POU-БЕЛКИ КАК ПРЕДСТАВИТЕЛИ СЕМЕЙСТВА ГОМЕОБЕЛКОВ: АНАЛИЗ ВЫРАВНИВАНИЯ И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ.