Функции генов и их продуктов. Онтологии, GO.

1. Поиск нужного термина в словарях GO.

   Итак, белок из организма Danio rerio (полосатая рыбка; "рыба-зебра") локализован в аппарате Гольджи (см. задание). На главном сайте консорциума GO, http://www.geneontology.org/, ведется поиск наиболее подходящего термина GO:
   для этого заполняется поле "Search for genes, proteins or GO terms using AmiGO" (с отмеченным "GO term or ID"). Для поиска задаем "Golgi apparatus" (найдено 6 терминов, 2 из них отвечают клеточной структуре. На вход можно подать и Golgi complex; поиск ведется даже "по частям слов" - так запрос на "Gol tus" выдает искомое (естественно, в выдаче - все термины, в которых встеречается заданное "словосочетание" )); в результате получаем список находок, которые в дальнейшем можно отсортировать (добавив фильтр "Cellular Component").

   • Полученный термин GO - Golgi apparatus; идентификатор - GO:0005794; синонимы - Golgi, Golgi complex (более узкое понятие - Golgi ribbon).
     "Положение" (общ.):
     
     • клеточный компонент
     • в клетке
     • в части клетки
     • внутриклеточный
     • внутриклеточный компонент
     • цитоплазма
     • компонент цитоплазмы
     • аппарат Гольджи

   • Определение: это цитоплазматическая органелла эукариотов, представляющая собой целостное мембранное образование. Состоит из уплощенных, безрибосомных мемебранных мешков (цистерн), собранных вместе. Аппарат Гольджи отличается от эндоплазматического ретикулума зачастую чуть большей толщины мембранами, характерно расположенными стопками полукругом так, что проксимальный (формирующийся, цис-) участок контактирует с ЭПР; в дистальном участке (зрелом, транс-) происходит разделение, сортировка секретируемых продуктов. В клетках позвоночных такая структура обычна одна; у растений и беспозвоночных (где подобные структуры именуются диктиосомами - ? - прим. - интересно, но "стопки плоских мемебранных мешков" вообще и у позвоночных называются диктиосомой) - может быть несколько диктиосом, раскиданных по всей цитоплазме.
     В аппарате Гольджи идет созревание белков, образовавшихся в рибосомах шероховатого ЭПР, включающее вторичную модификацию гликопротеидов, трансгликозилирование (все - модификация олигосахаридных цепей); сортировку, разделение белков, предназначенных для транспорта в различные части клетки. Выделяют 3 участка (по структуре и функциям) аппарата Гольджи: цис- , транс-зоны и промежуточная (между цис- и транс-зонами).
     [источник: ISBN:0198506732]

   • Комментарий: аппарат Гольджи (АГ) может располагаться в различных частях цитоплазмы. Так, у растений и низших животных АГ представлен "множественными копиями" обособленных стопок, распределенных в цитоплазме; в то время как АГ интерфазных клеток клеток млекопитающих расположен рядом с ядром, зачастую образует сеть - соединение отдельных стопок в компактную и связанную ленту.

   • Название онтологии GO: cellular component - клеточный компонент. Описание: "клеточный компонент - фактичеки компонент клетки, с той лишь оговоркой, что это часть какого-то большого объекта; это может быть как анатомическая структура (например, шероховатый ЭПР или ядро), так и связанное с продуктом гена (димер белка, рибосома и пр.). За более подробной информацией предлагается ознакомиться с документацией - здесь содержится полная информация (данная онтология описывает расположение, уровни клеточных структур и макромолекулярные комплексы; кроме того, сюда включены белковые комплексы; не включены - отдельные белки, аминокислоты, внутриклеточные "мультиобразования") с разобранными примерами.

2. Описание функции конкретного белка с помощью GOA.

   На главной странице БД GOA в поле запроса вводится AC UniProt белка L-аспарагиназы - P00805. В результате открывается страничка со списком всех терминов GO, ассоциированным с данной записью UniProt. По данным этой странички заполняется таблица следующего вида:

   	Онтология GO (имя)	Количество ассоциированных терминов GO	Краткий ответ на вопрос
   Где?	Клеточный компонент (component)	1	В периплазматическом пространстве (это пространство между внутренней (цитоплазматической) и наружной мембранами (Грам-отрицательные бактерии; а, например, для грибов - про-во между мембраной и клеточной стенкой); GO ID: GO:0042597)
   Зачем, для чего?	Биологический процесс (process)	2	Участие в метаболизме аминокислот (=рацемизации L-аминокислот; GO:0006520); в метаболизме аспарагина (GO:0006528).
   Молекулярный механизм?	Функция (function)	2 (3 находки)	аспарагиназная активность: катализ реакции L-аспарагин + H2O = L-аспартат + NH3 [ L-asparagine + H2O = L-aspartate + NH3 ] (GO:0004067); гидролазная активность: катализ гидролиза различных связей (например, C-O, C-N, C-C, фосфорно-ангидридных и пр.; GO:0016787 ).
   Специфичность?	-	-	"Прямой" информации нет. Но по данным InterPro: IPR004550 (для GO:0004067), существует близких семейства аспарагиназ, причем L-аспарагиназа II - высокоаффинный белок (обладает высокой степенью сродства к субстрату), в то время как L-аспарагиназа I - низкоаффинный белок.

   Все данные представлены по результатам электронной аннотации - IEA. В разделе "Источники" - "Source" - yказаны БД InterPro и UniProt (наблюдение: в разделе "function" количество ассоциированных терминов GO - 3, но 2 из них - одинаковые (GO:0004067 для InterPro и UniProt Enzyme Code)).
   На страничках имеются графы, отражающие связи между терминами.

3. Создание больших выборок белков с определенными функциями (поиск по идентификаторам GO в БД UniProt с помощью SRS)

   "Тренировка в поиске":

   • отработка структуры запроса - составляется 1 запрос в SRS для того, чтобы получить сразу 3 документа P15650, P70618 и P51650 (все три белка из организма RATTUS NORVEGICUS (RAT)): P15650 | P70618 | P51650 в поле "AllText" [ (([uniprot-AllText:P15650*] | [uniprot-AllText:P70618*]) | [uniprot-AllText:P51650*]) ].

   • идентификаторы GO записаны в поле DR документа;
     причем в UniProt буквами обозначают онтологии: F - функция (function); P - процесс (process); С - компонент (component).

   • трехбуквенное обозначение вводится для качества аннотаций (код обоснования аннотации): так, например, ISS - Inferred from Sequence Similarity - низкое качество аннотации; а вот IDA - Inferred from Direct Assay и TAS - Traceable Author Statement соответствуют лучшему доказательству функции.

   • 	P15650	P70618	P51650
     митохондриальный белок	+		+
     ядерный белок		+
     белок с самым низким качеством аннотации (термины присвоены по ISS)		+

   Теперь непосредственно задача: оценить, насколько хорошо аннотированы в UniProt функции белков Danio rerio аппарата Гольджи.
   Результаты - см. таблицу (курсивом в строке с запросом выделяется выбранное поле (раздел) поиска):

   Протеом Danio rerio Результаты поиска в UniProt, исправлено 02.04.2007 г.

   	Количество записей	Запрос
   Всего	20343	Organism Name Danio rerio (([uniprot-Organism:Danio*] & [uniprot-Organism:rerio*]) | [uniprot-Organism:Danio rerio*])
   С идентификаторами всех 3-х онтологий GO	4023	Organism Name Danio rerio & DBxref_ GO: & F: & P: & C: ((([uniprot-Organism:Danio*] & [uniprot-Organism:rerio*]) | [uniprot-Organism:Danio rerio*]) & ((([uniprot-DBxref_:GO:*] & [uniprot-DBxref_:F:*]) & [uniprot-DBxref_:P:*]) & [uniprot-DBxref_:C:*]))
   В том числе в аппарате Гольджи *, **	10	Organism Name Danio rerio & DBxref_ GO: & F: & P: & C: & GO:0005794 ((([uniprot-Organism:Danio*] & [uniprot-Organism:rerio*]) | [uniprot-Organism:Danio rerio*]) & (((([uniprot-DBxref_:GO:*] & [uniprot-DBxref_:F:*]) & [uniprot-DBxref_:P:*]) & [uniprot-DBxref_:C:*]) & [uniprot-DBxref_:GO:0005794*]))
   В том числе только с самыми хорошими доказательствами функции (коды только IDA и TAS)	0	Organism Name Danio rerio & DBxref_ GO: & F: & P: & C: & GO:0005794 & (IDA: | TAS: !ISS: ! IEA: ! IMP: ! IGI: ! IPI: ! RCA: ! IEP: ! NAC: ! IC: ! ND:)
   В том числе те, у которых встречается хотя бы один раз самое хорошее доказательство функции (есть коды IDA или TAS)	0	Organism Name Danio rerio & DBxref_ GO: & F: & P: & C: & GO:0005794 & (IDA: | TAS:)

   * - вариант запроса для аппарата Гольджи (по сути тот же, что и в таблице - только в задании все-таки указывается на идентификатор GO) - Organism Name Danio rerio & DBxref_ GO: & F: & P: & C: & C:Golgi apparatus - ((([uniprot-Organism:Danio*] & [uniprot-Organism:rerio*]) | [uniprot-Organism:Danio rerio*]) & (((([uniprot-DBxref_:GO:*] & [uniprot-DBxref_:F:*]) & [uniprot-DBxref_:P:*]) & [uniprot-DBxref_:C:*]) & [uniprot-DBxref_:C:Golgi apparatus*]));

   В ходе поиска оказалось, что белков с хорошим доказательством функций (код обоснования аннотации - IDA, TAS) найдено не было; найденные в аппарате Гольджи белки (10 шт) имеют коды обоснования аннотации ISS (Inferred from Sequence Similarity; 3 белка) и IEA (Inferred from Electronic Annotation; 7 белков) - низкое качество... Хороших доказательств функции (например, по данным оригинальной статьи) обнаружено не было.

   *, ** - Вопрос: а как вообще еще можно вести поиск, начиная с пункта "В том числе в аппарате Гольджи"? (если предположить, что ищем не по идентификатору GO:0005794 (наиболее полно описывает локализацию белков в аппарате Гольджи)). Просто тут есть такой вариант: указываем в строке запроса

   Organism Name Danio rerio & DBxref_ GO: & F: & P: & C: & C:Golgi

   ((([uniprot-Organism:Danio*] & [uniprot-Organism:rerio*]) | [uniprot-Organism:Danio rerio*]) & (((([uniprot-DBxref_:GO:*] & [uniprot-DBxref_:F:*]) & [uniprot-DBxref_:P:*]) & [uniprot-DBxref_:C:*]) & [uniprot-DBxref_:C:Golgi*]))

   
   В таком случае, число находок увеличивается. Теперь их 24 и среди них есть, например, белки, которые участвуют в везикулярном переносе (например, между аппаратом Гольджи и ЭПР).
   Конкретный пример: "новый" белок Q6PFM7; онтология - где? - C:Golgi membrane; идентификатор GO:0000139 - "часть" аппарата Гольджи (билипидный слой, окружающий любой из компартментов АГ). Тогда для другого, без идентификатора варианта поиска:

   	Количество записей	Запрос
   В том числе в аппарате Гольджи **	24	Organism Name Danio rerio & DBxref_ GO: & F: & P: & C: & C:Golgi ((([uniprot-Organism:Danio*] & [uniprot-Organism:rerio*]) | [uniprot-Organism:Danio rerio*]) & (((([uniprot-DBxref_:GO:*] & [uniprot-DBxref_:F:*]) & [uniprot-DBxref_:P:*]) & [uniprot-DBxref_:C:*]) & [uniprot-DBxref_:C:Golgi*]))
   В том числе только с самыми хорошими доказательствами функции (коды только IDA и TAS)	1	Organism Name Danio rerio & DBxref_ GO: & F: & P: & C: & C:Golgi & (IDA: | TAS: !ISS: ! IEA: ! IMP: ! IGI: ! IPI: ! RCA: ! IEP: ! NAC: ! IC: ! ND:) ((([uniprot-Organism:Danio*] & [uniprot-Organism:rerio*]) | [uniprot-Organism:Danio rerio*]) & ((((([uniprot-DBxref_:GO:*] & [uniprot-DBxref_:F:*]) & [uniprot-DBxref_:P:*]) & [uniprot-DBxref_:C:*]) & [uniprot-DBxref_:C:Golgi*]) & ((((((((((([uniprot-DBxref_:IDA:*] | [uniprot-DBxref_:TAS:*]) ! [uniprot-DBxref_:ISS:*]) ! [uniprot-DBxref_:IEA:*]) ! [uniprot-DBxref_:IMP:*]) ! [uniprot-DBxref_:IGI:*]) ! [uniprot-DBxref_:IPI:*]) ! [uniprot-DBxref_:RCA:*]) ! [uniprot-DBxref_:IEP:*]) ! [uniprot-DBxref_:NAC:*]) ! [uniprot-DBxref_:IC:*]) ! [uniprot-DBxref_:ND:*])))
   В том числе те, у которых встречается хотя бы один раз самое хорошее доказательство функции (есть коды IDA или TAS)	2	Organism Name Danio rerio & DBxref_ GO: & F: & P: & C: & C:Golgi & (IDA: | TAS:) ((([uniprot-Organism:Danio*] & [uniprot-Organism:rerio*]) | [uniprot-Organism:Danio rerio*]) & ((((([uniprot-DBxref_:GO:*] & [uniprot-DBxref_:F:*]) & [uniprot-DBxref_:P:*]) & [uniprot-DBxref_:C:*]) & [uniprot-DBxref_:C:Golgi*]) & ([uniprot-DBxref_:IDA:*] | [uniprot-DBxref_:TAS:*])))

   Оказывается, для 1 белка - Q5W7F1 - приведено только хорошее доказательство функции (IDA).

   Итак, плоховато, прямо скажем, присвоены в UniProt идентификаторы GO для функций белков Danio rerio: только для 19% всех белков протеома имеются все 3 идентификаторы GO; для интересующих меня белков аппарата Гольджи также "полных аннотаций" (т.е. все 3 идентификатора) мало (около 0.05%); причем для абсолютного большинства из них по кодам аннотации можно судить о низком качестве аннотации.

   А приведенные 2 "варианта поиска" (2 разных подхода к решению одной задачи) поучительны в смысле трактовки задания. И это еще одно доказательство необходимости применения единой формальной терминологии при создании качественной аннотации. И понимания вообще.

Дополнительные упражнения.

• Описание связей между терминами в онтологиях GO.

  На странице БД GOA со списком всех терминов GO, ассоциированным с нужной записью UniProt - AC P00805 (см. упр.2. выше) отмечаются галочкой все термины и нажимается кнопка View selected terms in context. На открывшемся графе показаны связи между терминами.
  Как обозначаются связи разных типов:

  

  
  Предлагается найти пример конкретного термина, имеющего связи более, чем с 2-мя родительскими терминами (причем связи типа "is a" ("A is B" означает, что А - частный случай В) и "part of "("A is part of B" означает, что А - часть В, но В не обязательно содержит А )). Но именно такой пример найти не получается - на рассматриваемом графе есть единственный пример: только термин amino acid metabolic process связан с 3мя родительскими терминами (и все 3 связи типа "is a"):

  
  т.е. метаболизм аминокислот - частный случай процессов "метаболизм карбоновых аминокислот", "метаболизм аминокислот и их производных", "метаболизм аминов" (это родительские термины для термина "метаболизм аминокислот");
  например, метаболизм аминов означает "метаболизм производных аммиака, "полученных" замещением в нем атомов водорода на углеводородные радикалы" (аминокислоты - "частный случай" аминов);
  а под "метаболизмом карбоновых аминокислот" понимается метаболизм производных углеводородов, содержащих в молекуле группировку СООН (в том числе и аминокислот, которые являются производными карбоновых кислот (сод. группировку -NH₂ при С-альфа атоме)).

  А вот пример, содержащий связи типа "is a" и "part of":

  

  "Часть клетки" - частный случай понятия "Клеточный компонент" (is a); в то время как понятия "клетка" и "часть клетки" связаны отношением "part of": не все то, что относится к "части клетки", является обязательным компонентом "клетки", а может быть характерно только для определенного типа клеток (например, дочерним термином для "части клетки" (GO:0044464) является термин "аксонный холмик" (GO:0043203) - основание аксона (! только для клеток нервной ткани) ). Т.е. "cell part" не является обязательным компонентом "cell".

• Описание функции белка в БД EcoCyc.

  Изучено описание функции белка L-аспарагиназы (АС P00805) в БД EcoCyc - электронной энциклопедии генов и особенностей метаболизма Escherichia coli K-12. K таблице из упр.2 добавлен еще один столбец - "Данные EcoCyc" (предполагается внесение в соответствующие ячейки таблицы информации, существенно дополняющей аннотацию GO):

Непросто в формат таблицы поместить всю информацию. Итак, в EcoCyc еще приведены следующие данные:
• синонимы: B2957 , AnsB , L-аспарагин аминогидролаза II , AsnII , L-аспарагиназа II;
• синтез L-аспарагиназы индуцируется в анаэробных условиях, предмет регуляции цАМФ рецептора;
• указана роль белка в терапии онкологических заболеваний;
• белок состоит из 4х субъединиц - тетрамер;
• название гена - аnsB; длина аминокислотной последовательности (348 а.о.); молекулярный вес (36.851 kD) - ну это достаточно "тривиальные" данные;
• в схеме: о L-аспарагиназах I и III и соответствующих генах: ansA, iaaA;
• подчеркивается отличие от L-аспарагиназы I, активность которой не зависит от уровня кислорода;
• ингибиторе - L-аспарагине (механизм действия неизвестен);
• и др.

  Приводятся ссылки на экспериментальные статьи - это подтверждение высокой надежности данных.

• Исследование качества аннотации группы белков в UniProt.

  Расшифровка кодов:

  экспериментальныe доказательства:

  • IDA: Inferred from Direct Assay;
  • IEP: Inferred from Expression Pattern;
  • IGI: Inferred from Genetic Interaction;
  • IMP: Inferred from Mutant Phenotype;
  • IPI: Inferred from Physical Interaction;
  • TAS: Traceable Author Statement - **;

  компьютерные доказательства:

  • IC: Inferred by Curator - **;
  • IEA: Inferred from Electronic Annotation;
  • IGC: Inferred from Genomic Context;
  • ISS: Inferred from Sequence or Structural Similarity;
  • RCA: inferred from Reviewed Computational Analysis;

  недостоверные/код не присвоен:

  • NAS: Non-traceable Author Statement;
  • ND: No biological Data available;
  • NR: Not Recorded.

  ** - вообще, трудно отнести к чисто экспериментальным/компьютерным доказательствам.
  Предлагается оценить долю компьютерных аннотаций GO в UniProt для белков из аппарата Гольджи (организм Danio rerio); это значит, что в документах, найденных по соответствующему запросу нужно определить суммарное число идентификаторов GO (грубо говоря, сколько строчек с идентификатором встречается в документе - технически, решается эта задача использованием команды "grep") и число строчек, в которых имеются идентификаторы GO с компьютерным аннотированием.
  Для решения поставленной задачи необходимо изучить все возможности SRS-поиска и использовать расширенную форму поиска (Extended Query Form; хотя, наверно, можно эту задачу решить и стандартным поиском...).

  В соответствующие поля 'OrganismName', 'DBxref' вносим запросы "Danio rerio", "GO:0005794"; далее - в левом окошке вносим параметры "Combine search terms..." - "&", "View results using: UniProt", "Create a list" и запускаем поиск. Строка запроса:

  ((([uniprot-Organism:Danio*] & [uniprot-Organism:rerio*]) | [uniprot-Organism:Danio rerio*]) & [uniprot-DBxref_:GO:0005794*])

  В результате получаем "выдержки" 9 документов; выдача сохранена в текстовом файле.

  ВНИМАНИЕ! Результаты поиска приведены по состоянию на 22.03.2007!!!!

  Полученный файл подается на вход программе grep; вот вид команды:
  

  grep GO: res.txt -c

  (параметр -c для подсчета числа интересующих строк). Результат: 56 строк, содержащих идентификаторы GO.
  Далее - подсчет строк, в которых содержится код компьютерного доказательства ISS:

  grep GO:.*ISS: res.txt -с

  Результат: 31 строка.
  Потом - подсчет строк, в которых содержится код компьютерного доказательства IЕА:

  grep GO:.*IЕА: res.txt -с

  Результат: 25 строк.
  Вообще теперь надо бы искать по кодам IGC: ; RCA: , но в этом уже нет небходимости, т.к. 25 + 31 = 56; все строчки "перебраны". Итак,
  • доля компьютерных аннотаций = ^{число компьютерных аннотаций GO у белков АГ Danio rerio с только компьютерными аннотациями GO}/_{общее число идентификаторов GO у белков АГ Danio rerio;}

  • доля компьютерных аннотаций = (25 + 31)/56 = 1 - это 100%;

  Абсолютное преобладание доли компьютерных аннотаций GO (идентификаторов GO с другими типами аннотаций найдено не было), объясняется тем, что компьютерное аннотирование значительно проще экспериментального (котороe сложно технически + долго по времени
  [несмотря на то, что Danio rerio - один из наиболее популярных объектов биологии развития позвоночных животных, благодаря легкости культивирования, получения массового материала, быстроте наступления репродуктивного периода (около трех месяцев), высокой скорости эмбрионального развития и возможности получения гаплоидного потомства (что облегчает его генетический анализ), прозрачности зародыша (удобство для микроскопирования и киносъемки) - активное "пристально" изучается сранительно недавно]).