Второй семестр

Информация о моем белке (зачетное задание ?1).

Банк последовательностей белков UniProt

1. Данные о моем белке (Uniprot):

	Метка поля	Содержание
Код(ы) доступа ("Accession number")	AC	P77791; Q2MBW8
Идентификатор записи в БД	ID	MAA_ECOLI
Название (краткое описание) белка	DE	RecName: Full=Maltose O-acetyltransferase; EC=2.3.1.79 AltName: Full=Maltose transacetylase
Дата создания документа	DT	01-NOV-1997
Дата последнего исправления аннотации	DT	16-DEC-2008
Число публикаций, использованных при создании документа	RN	6
Журнал и год самой поздней публикации	RL	Mol. Syst. Biol. 2:E1-E5(2006).
Ключевые слова	KW	3D-structure; Complete proteome; Direct protein sequencing; Repeat; Transferase.
Что содержит поле комментариев?	CC	Функция: ацетилирует мальтозу и другие сахара. Каталитическая активность: ацетил-CoA + мальтоза = CoA + ацетил-мальтоза Биофизические свойства: кинетические параметры: (Константа Михаэлиса) KM=62 mM для глюкозы; KM=90 mM для мальтозы; Vmax=0.20 ммоль/мин/мг фермент с глюкозой в основании; Vmax=0.11 ммоль/мин/мг фермент с мальтозой в основании; Примечания: ацителирует глюкозу, мальтозу, маннозу, галактозу с уменьшающейся относительной нормой: 1, 0.55, 0.20, 0.07, 0.04; Структура: гомодимер; Сходство: Принадлежит к семье гексапептидных трансфераз.
Идентификаторы записей PDB	DR	1OCX

 

2. Вопросы:

1) Последовательности большинства белков начинаются с метионина. Почему?
После биосинтеза в процессе созревания белка метионин может быть удален. Указан ли метионин в начальной позиции заданного белка?
А удаляется ли он потом?
2) Как называется субстрат, с которым фермент работает быстрее всего? .

Ответы:

1) Так как с него начинается трансляции всех мРНК, и , соответственно, синтез белков. (бактериальные белки начинаются с N-формилметионина, потому что их старт кодоны соответсвуют тРНК, несущей его)
Да, метеонин стоит на первом месте в последовательности аминокислот моего белка. В http://www.uniprot.org/uniprot/P77791 указано, что Initiator methionine Removed, но в последовательности он присутствует, значит метеонин отщепляется уже после трансляции.
2)Белок ацетилируюет глюкозу, мальтозу, маннозу, галактозу и фруктозу, но быстрей всего из них - глюкозу.



Поиск в Uniprot белков, схожих с моим:

Запрос	Число записей в SwissProt	Число записей в TrEMBL
"Maltose O-acetyltransferase"	2	262
"EC=2.3.1.79"	2	194
"Maltose O-acetyltransferase (EC=2.3.1.79)"	2	192
"Maltose transacetylase"	2	40

3. Рассмотрим один из белков, которые по данным Uniprot близки моему:

	Метка поля	P77791	P37515
Первый код доступа	AC	P77791	P37515
Идентификатор последовательности в БД	ID	MAA_ECOLI	MAA_BACSU
Название (краткое описание) белка	DE	RecName: Full=Maltose O-acetyltransferase; EC=2.3.1.79	RecName: Full=Probable maltose O-acetyltransferase; EC=2.3.1.79
Дата создания документа	DT	01-NOV-1997	01-OCT-1994
Дата последнего исправления аннотации	DT	16-DEC-2008	20-JAN-2009
Название организма	OS	Escherichia coli (strain K12)	Bacillus subtilis
Классификация организма (список таксонов)	OC	Bacteria ' Proteobacteria ' Gammaproteobacteria ' Enterobacteriales ' Enterobacteriaceae ' Escherichia.	Bacteria ' Firmicutes ' Bacillales ' Bacillaceae ' Bacillus.
Длина последовательности	SQ	183	184
Молекулярная масса белка	SQ	20,096	20,210
Число публикаций, использованных при создании документа	RN	6	3
Журнал и год самой поздней публикации	RL	Mol. Syst. Biol. 2:E1-E5(2006)	Nature 390:249-256(1997)
Описание вторичной структуры	FT	Да, большая часть структуры состоит из альфа-спиралей и бета-тяжей, 1 небольшой участок с бета-поворотом.	Нет.
Ключевые слова	KW	3D-structure; Complete proteome; Direct protein sequencing; Repeat; Transferase.	Complete proteome; Repeat; Transferase.
Темы, освещенные в комментариях	CC	Каталитическая активность, биофизические свойства, функции, структура, сходство.	Каталитическая активность, сходство.
Особенности последовательности	FT	Может отсутствовать 1-ая аминокислота - инициатор метеонина.	Вероятная мальтозо - ацетил-трансфераза..
Идентификаторы записей PDB	DR	1K3P; 1NXE; 1NXG; 1OWB; 1OWC	1431

 ВЫВОД: Белок P77791 лучше исследован, известна его вторичная структура, точные функции и т.д., несмотря на то что первая публикация о белке P37515 появилась на 3 года раньше. Белки сходны по строению, так что, на основании исследований E.coli можно делать выводы о функционировании белка Bacillus subtilis.
 

Поисковая система SRS

Последовательности аминокислот, найденных по запросу: ([swissprot-Taxonomy:Gammaproteobacteria*] & [swissprot-Description:acetyltransferase] в fasta-формате.

Работа с системой PubMed

Пути эволюции аминокислотных последовательностей. Пробное выравнивание.

Парные выравнивания аминокислотных последовательностей

maa_ecoli  92 -CPIRIGDNCMLAPGVHIYTATH------------PIDPVARNSGAELGK 128
capg_staau 43 PYLIQIGNHVTITSGVKF--ATHDGGVWIFRKKYPEIDNFHR-------- 82 

maa_ecoli 101 MLAPGVHIYTATHPIDPVARNSGAELGKP----------VTIGNNVWIGG 140
capg_staau 44 YLIQIGNHVTITSGVKFATHDGGVWIFRKKYPEIDNFHRIFIGNNVFIGI 93

maa_ecoli  76 LGNNFFANFDCVMLDV---------CPIRIGDNCMLAPGVHIYTATH--- 113
capg_staau 25 VGN------DCRFLSVDRSTFGSEPYLIQIGNHVTITSGVKF--ATHDGG 66 

maa_ecoli  92 CPIRIGDNCMLAPGVHIYTATHP-IDPVARNSGAELGKPVTIGNNVWIGG 140
capg_staau 65 -----G-------GVWIFRKKYPEIDNFHR---------IFIGNNVFIGI 93 

Поиск гипотетических гомологов изучаемого белка с фильтром по таксонам

Поиск белка по его фрагменту (SEDQQLLLERKHARQLIRQYN)

Результаты поиска белка в Swiss-Prot по фрагменту последовательности

Сравним выравнивания этих белков, полученные с использованием различных алгоритмов: MAA_BACSU - MAA_ECOLI

MAA_BACSU  2    LRTEKEKMAAGELYNSEDQQLLLERKHARQLIRQYNET-PEDDAVRTKLLKELLGSVGDQ  60      
MAA_ECOLI  1    MSTEKEKMIAGELYRSADETLSRDRLRARQLIHRYNHSLAEEHTLRQQILADLFGQV-TE  59

MAA_BACSU  61   VTILPTFRCDYGYHIHIGDHTFVNFDCVILDVCEVRIGCHCLIAPGVHIYTAGHPLDPIE  120
MAA_ECOLI  60   AYIEPTFRCDYGYNIFLGNNFFANFDCVMLDVCPIRIGDNCMLAPGVHIYTATHPIDPVA  119

MAA_BACSU  121  RKSGKEFGKPVTIGDQVWIGGRAVINPGVTIGDNAVIASGSVVTKDVPANTVVGGNPARI  180
MAA_ECOLI  120  RNSGAELGKPVTIGNNVWIGGRAVINPGVTIGDNVVVASGAVVTKDVPDNVVVGGNPARI  179

MAA_BACSU  181  LKQL  184
MAA_ECOLI  180  IKKL  183

MAA_BACSU  1 MLRTEKEKMAAGELYNSEDQQLLLERKHARQLIRQYNET-PEDDAVRTKL     49   
MAA_ECOLI  1  MSTEKEKMIAGELYRSADETLSRDRLRARQLIHRYNHSLAEEHTLRQQI     49

MAA_BACSU  50 LKELLGSVGDQVTILPTFRCDYGYHIHIGDHTFVNFDCVILDVCEVRIGC     99
MAA_ECOLI  50 LADLFGQV-TEAYIEPTFRCDYGYNIFLGNNFFANFDCVMLDVCPIRIGD     98

MAA_BACSU  100 HCLIAPGVHIYTAGHPLDPIERKSGKEFGKPVTIGDQVWIGGRAVINPGV    149
MAA_ECOLI  99 NCMLAPGVHIYTATHPIDPVARNSGAELGKPVTIGNNVWIGGRAVINPGV    148

MAA_BACSU  150 TIGDNAVIASGSVVTKDVPANTVVGGNPARILKQL    184
MAA_ECOLI  149 TIGDNVVVASGAVVTKDVPDNVVVGGNPARIIKKL    183

MAA_BACSU  2    LRTEKEKMAAGELYNSEDQQLLLERKHARQLIRQYNET-PEDDAVRTKLLKELLGSVGDQ  60      
MAA_ECOLI  1    MSTEKEKMIAGELYRSADETLSRDRLRARQLIHRYNHSLAEEHTLRQQILADLFGQV-TE  59

MAA_BACSU  61   VTILPTFRCDYGYHIHIGDHTFVNFDCVILDVCEVRIGCHCLIAPGVHIYTAGHPLDPIE  120
MAA_ECOLI  60   AYIEPTFRCDYGYNIFLGNNFFANFDCVMLDVCPIRIGDNCMLAPGVHIYTATHPIDPVA  119

MAA_BACSU  121  RKSGKEFGKPVTIGDQVWIGGRAVINPGVTIGDNAVIASGSVVTKDVPANTVVGGNPARI  180
MAA_ECOLI  120  RNSGAELGKPVTIGNNVWIGGRAVINPGVTIGDNVVVASGAVVTKDVPDNVVVGGNPARI  179

MAA_BACSU  181  LKQL  184
MAA_ECOLI  180  IKKL  183

Биологический смысл выравнивания последовательностей белков

на основании пространственного наложения их структур:
(последовательность ?9 раскрашена в красный цвет, ?10 - соответственно в зеленый)

Скачать выравнивание в формате msf.


Далее мною было произведено оптимальное выравнивание с помощью программы needle:



















Скачать выравнивание в формате msf.


Вывод: программа needle произвела оптимальное выравнивание, высчитывая математическими методами наибольший вес выравнивания; при выравнивании вручную я пользовался биологическими методами: сравнением пространственных структур и расположения консервативных остатков. В итоге, глобальное выравнивание выдало математически правильный, но биологически неточный результат. Несмотря на это, в обоих выравниваниях много совпадающих участков.


Наверх

Множественное выравнивание

Ознакомление с программой Muscle:
Для множественного выравнивания возьмем вирусные белки - "дельта-антигены".(Посмотреть последовательности в fasta-формате).
Данные белки были найдены мной по запросу в SRS: ([swissprot-Description:delta*] & [swissprot-Taxonomy:deltavirus*]).

Вот выравнивание, проделанное программой muscle (fasta - формат).

А вот оно же, импортированное в GeneDoc:



Тут можно скачать это выравнивание в формате msf.

Вывод: В файлах с выравниванием программой muscle белки даны в иной последовательности, чем были расположены в исходном файле. Во всех белках присутствует очень много сходных консервативных аминокислот (что является следствием их принадлежности к одному классу). Ну и, разумеется выравнивание в формате msf гораздо нагляднее и удобнее для анализа, чем в fasta - формате.

Далее, проделаю то же самое выравнивание, но вручную:



Тут можно скачать это выравнивание в формате msf.


Выравнивания очень похоже! Основное различие - в порядке аминокислотных последовательностей.


Выравнивание набора гомологов белка MAA_ECOLI:
(для выравнивания были отобраны 5 гомологов принадлежащих таксону Bacteria, с E-value<0.001, с процентами идентичности от 30 до 80, и наиболее удаленные друг от друга в заданных рамках.)
Выравнивание в fasta-формате
Выравнивание в формате msf




Участок с повышенной долей консервативных позиций:
Координаты по остаткам моего белка (MAA_ECOLI):132-178; по столбцам выравнивания:154-200.

Участок с небольшой долей консервативных позиций:
Координаты по остаткам моего белка:81-102; по столбцам выравнивания:85-106.
.
Участки, где выравнивание скорее всего не имеет биологического смысла:
1. Координаты по остаткам моего белка:1-80; по столбцам выравнивания:1-84.
2. Координаты по остаткам моего белка:103-131; по столбцам выравнивания:107-153.
3. Координаты по остаткам моего белка:179-183; по столбцам выравнивания:201-251.



Наверх

Мотивы, паттерны и профили

Рассмотрим наш фрагмент множественного выравнивания.
Создаем 3 паттерна.

1. Первый паттерн в точности является фрагментом последовательности моего белка (то есть только одной из последовательностей выравнивания).
2. Второй ("сильный") паттерн надо постараться построить так, чтобы он распознавал все белки моей выборки, и только их.
3. Третий ("слабый") паттерн надо создать на основе второго, сделав требования к последовательности более мягкими.

Проведу поиск последовательностей банка Swiss-Prot, включающих мотивы, соответствующие каждому из полученных паттернов.

Таблица результатов поиска по паттернам в базе данных SwissProt:

Характеристика паттерна	Паттерн	В скольких последовательностях банка Swiss-Prot найден мотив, удовлетворяющий паттерну?	Все ли последовательности из Вашего выравнивания найдены?
Фрагмент последовательности	RYLFPDRDDV	в 1	Нет
Сильный	[RKAND]-[YNH]-[LFVAT]-[FY]-[PAVM] -[DN]-[RFS]-[DN]-X(0,4)-D-[VDG]	в 7	Все
Слабый	[FY]-[PAVM]-{A}-[RFS]-[DN]-X(0,4)-D-[VDG]	в 1003	Все

Первый паттерн - это фрагмент последовательности моего белка MAA_ECOLI, а те последовательности, которые имеют гэпы или не совпадают, нам не подходят. Второй, более сильный паттерн, одновременно и более мягкий, он нашел все последовательности. Самый мягкий паттерн (слабый) выявил большое количество последовательностей белков, не только из семейств моего белка, но и из других таксонов. Из всего этого можно сделать вывод - самый оптимальный паттерн - сильный, так как он находит нужное нам число последовательностей белка, и по возможности не находит лишние белки.

Все описанные в PROSITE мотивы в заданном белке MAA_ECOLI

Идентификатор документа PROSITE (AC)	Название мотива	Краткое описание мотива	Тип подписи (паттерн, профиль)	Паттерн (регулярное выражение)	Специфична ли подпись?	Сколько мотивов нашлось в белке?
PS00101	HEXAPEP_TRANSFERASES	Сайт повторяющихся гексапептидов, содержащих трансферазы	паттерн	[LIV] - [GAED] - x(2) - [STAV] - x - [LIV] - x(3) - [LIVAC] - x - [LIV] - [GAED] - x(2) - [STAVR] - x - [LIV] - [GAED] - x(2) - [STAV] - x - [LIV] - x(3) - [LIV]	специфична	1
PS00005	PKC_PHOSPHO_SITE	Сайт фосфорилирования казеинкиназы С	паттерн	[ST] - x - [RK]	неспецифична	3
PS00006	CK2_PHOSPHO_SITE	Сайт фосфорилирования казеинкиназы II	паттерн	[ST] - x(2) - [DE]	неспецифична	5
PS00008	MYRISTYL	Сайт N-миристоилирования	паттерн	G - {EDRKHPFYW} - x(2) - [STAGCN] - {P}	неспецифична	4
PS00001	ASN_GLYCOSYLATION	Сайт N-гликолизации	паттерн	N - {P} - [ST] - {P}	неспецифична	1

Мотив в аминокислотной последовательности - набор консервативных остатков, важных для функции белка и расположенных на определенном расстоянии друг от друга в последовательности. Специфичный мотив всего один, характерный для данного белка, а неспецифичных гораздо больше, но с короткими паттернами, вследствие того что такие мотивы могут принадлежать белкам из разных таксонов.


Наверх

PSI-BLAST

Задание 1 Проведем работу с четырьмя аминокислотными последовательностями. Первые три последовательности имеют в Swiss-Prot номера доступа P18196, P0A832, P0A780; четвертая – последовательность моего белка (MAA_ECOLI). Для этих последовательностей проводим итеративный поиск по банку Swiss-Prot программой PSI-BLAST. При поиске всем параметрам (кроме банка поиска и программы) оставляем значения по умолчанию. Выполняем до пяти итераций, пока появляются новые последовательности выше порога 0,005 на E-value; если же и после пятой итерации список не стабилизировался, можно на этом остановиться. ID белка AC белка Число итераций Для первой итерации Для последней итерации Число находок выше порога (0,005) Худшее E-value выше порога Лучшее E-value ниже порога Число находок выше порога (0,005) Худшее E-value выше порога Лучшее E-value ниже порога MINC_ECOLI P18196 5 124 0.004 0.005 239 0.003 0.007 SSRP_ECOLI P0A832 2 449 3е-10 5.0 449 8е-31 0.62 NUSB_ECOLI P0A780 4 327 0.003 0.008 388 2е-12 0.031 MAA_ECOLI P77791 5 144 0,004 0,005 1303 0,003 0,005 Выводы: MINC_ECOLI "разошелся", т.к. даже после 5-й итерации список не стабилизировался, т.е. продолжали появляться новые находки, размывающие результат. SSRP_ECOLI и NUSB_ECOLI "сошлись": в первом случае вторая итерация выдала нам столько же находок, сколько и первая, и новых находок не появилось, поэтому мы можем сразу утверждать, что белок "сходится". Во втором случае новые находки перестали появляться после 4-ой итерации. Мой белок также "разошелся", т.к и после 5-ой итерации BLAST продолжал находить новые белки. В случае с последовательностями, которые "сошлись", E-value худшей находки выше порога резко уменьшался с каждой последующей итерацией, E-value лучшей находки ниже порога независимо от итераций мог увеличиваться или уменьшаться. Разрыв между лучшей и худшей находкой увеличивался с каждым разом. У разошедшихся последовательностей, E-value в обоих случаях менялся незначительно, и, при увеличении числа находок, разрыв между лучшей и худшей находками также менялся очень незначительно. Это может говорить о "расхождении" списка гомологов. Задание 2 "Не сошлись" интерации для белка MINC_ECOLI. Проведем опять поиск, изменив порог с 0.005 на 0.001.С таким параметром порога третья итерация "сошлась", вследствие того, что белок, размывающий результат, и , вероятно, негомологичный заданной последовательности, на этот раз не попал в список. Если увеличить порог до 0.002, то он опять попадет в список. Таким образом, снижение порога E-value можно использовать для улучшения результата поиска при "расхождении" белка.

Наверх