Документ взят из кэша поисковой машины. Адрес оригинального документа : http://kodomo.cmm.msu.ru/~da_shal/docs/protocol.doc Дата изменения: Tue Feb 26 21:35:52 2008 Дата индексирования: Tue Oct 2 08:57:42 2012 Кодировка: koi8-r

Семестр 2

Блок 1


Занятие 1: Банк SwissProt

Обязательные задания
1)Извлекаем из банка UniProt документ, содержащий информацию о белке
ybeY ECOLI, для чего переходим по адресу
http://www.expasy.ch/uniprot/P0A898.txt

2) С помощью полученной информации заполняем таблицу:
| |Метка|Содержание |
| |поля | |
|Код (ы) доступа ("Accession|AC |P0A898; P77385 |
|number") | | |
|Идентификатор записи в БД |ID |YBEY_ECOLI - (название белка) |
| | |Reviewed; |
| | |155 AA (его длина) |
|Название (краткое описание)|DE |Гипотетическая (спрогнозированная по |
|белка | |последовательности ДНК) металлопротеаза |
| | |(Putative metalloprotease ybeY) |
|Дата создания документа |DT |26 апреля 2005 года(26-APR-2005) |
|Дата последнего исправления|DT |05-FEB-2008 |
|аннотации | | |
|Число публикаций, |RN |5 |
|использованных при создании| | |
|документа | | |
|Журнал и год самой поздней |RL |Acta Crystallogr. F 61:959-963(2005) |
|публикации | | |
|Ключевые слова |KW |3D-structure; Complete proteome; Hydrolase; |
| | |Metal-binding; |
| | |Metalloprotease; Protease; Zinc. |
|Что содержит поле |CC |FUNCTION -функции белка |
|комментариев | |COFACTOR - кофактор |
| | |INTERACTION - возможно, взаимодействие |
| | |SIMILARITY - родство с другими белками, |
| | |принадлежность к семейству белков |
|Идентификаторы записей PDB |DR |1XM5 |

|Запрос |Число записей |Число записей |
| |в TrEMBL |в SwissProt |
|Putative |1877715 |9165 |
|metalloprotease |1642 |582 |
|Ybe |5674 |886 |
|ybeY |18 |0 |
|ybeX |17 |1 |
|ybeZ |15 |4 |
|EC 3.4.24.- |1173 |1186 |
|(EC 3.4.24.-) |1173 |1186 |
|Putative |483 |510 |
|metalloprotease | | |


3) Пользуясь поисковой машиной сайта Expasy, определяем, сколько записей в
UniProt описывает белки примерно с тем же описанием (DE), что и мой белок.
Результаты заносим в таблицу:











Получили следующие результаты:
1)Спрогнозированных по известной ДНК белков (putative) ОЧЕНЬ много.
2)Число записей в TrEMBL больше, чем в SwissProt (чаще всего).
3)Но самые интересные результаты дают запросы по имени белка. На
запрос «ybe» было найдено слишком большое количество белков и никаким
образом они не связаны. Но в информации о белке сказано, что есть схожий с
ним ybeZ, а значит можно поискать и ybeX. По запросу в SwissProt нашелся
белок: Magnesium and cobalt efflux protein corC. {GENE: Name=corC;
Synonyms=ybeX; OrderedLocusNames=b0658, JW0655} - Escherichia coli (strain
K12). Значит, видимо, как-то связаны гены, кодирующие белки X, Y и Z. По
запросу ybeZ нашли белки типа PhoH-like protein. GENE: Name=ybeZ;
OrderedLocusNames=b0660, JW0657}- Escherichia coli (strain K12) (в
SwissProt), а в TrEMBL еще и связывающие АТФ белки. И все эти белки
кодируются геном ybeZ. Также хочется отметить, что хоть изучаемый белок
принадлежит кишечной палочке, в результатах двух последних запросов есть не
только разные штаммы этой бактерии, но и многие другие организмы, в
частности, много записей по белкам шигелл и сальмонелл.
А потом женская интуиция подсказала мне попробовать другие буквы
латинского алфавита. На букву A нашлось много непонятных никак не связанных
белков, а вот буква М дала адекватный результат: Swiss-Prot(2) и
TrEMBL(14).Опять-таки это не имя белка, а имя гена: GENE: Name=ybeM, а
названия белков Putative amidase, Putative hydrolase, Putative
uncharacterized protein ybeM и hydrolase ybeM., и опять много сальмонелл и
шигелл. Еще три записи (Swiss-Prot(1) и TrEMBL(2)) нашлось по запросу ybeK.
И опять так называется ген, а организмы - E.coli и Saccharopolyspora
erythraea.
Итак, среди белков с именем вида ybe0 есть белки разных организмов, в
основном предсказанные на основе нуклеотидной последовательности,
выполняющие разные функции от транспорта до связывания АТФ и синтеза тРНК,
и объединены они по кодирующим их генам. Встает вопрос - что общего в генах
с именем вида ybe0 и почему они объединены в одно семейство.
Интересный результат дал запрос EC 3.4.24.-. Белков найдено много,
организмы разные. Значение этих букв и цифр я попробовала установить на
примере белка ATS17_HUMAN, который, очевидно, есть у человека. На странице,
описывающей белок EC 3.4.24.- - синоним названия белка, а ссылка с чисел
3.4.24.- ведет на страницу http://cn.expasy.org/enzyme/3.4.24.-. Значит,
это как-то связано с ферментами? Переходим по ссылке и видим (начало
страницы):
ENZYME: 3.4.24.-
Release of 05-Feb-2008
Hydrolases
Acting on peptide bonds (peptide hydrolases)
Metalloendopeptidases
All UniProtKB/Swiss-Prot entries corresponding to class 3.4.24.-.
The following ENZYME entries belong to class 3.4.24.-:
3.4.24.1 Atrolysin A.
3.4.24.2 Deleted entry.
3.4.24.3 Microbial collagenase.
3.4.24.4 Transferred entry: 3.4.24.25, 3.4.24.32, 3.4.24.39 and
3.4.24.40.
3.4.24.5 Transferred entry: 3.4.25.1.
3.4.24.6 Leucolysin.
3.4.24.7 Interstitial collagenase.
3.4.24.8 Transferred entry: 3.4.24.3.
3.4.24.9 Deleted entry.
3.4.24.10 Deleted entry.
.
Итак, речь идет о классе ферментов, разрывающих пептидную цепь (все
правильно - исходный мой белок называется metalloprotease). Значит, буквы
EC означают энзим, а цифры - различные группы ферментов. Тогда остается
непонятно одно - если белок принадлежит группе 3.4.24.-, почему последняя
цифра - пропуск? Понятно, что она своя у каждого белка в классе, но почему
имя белка (точнее, синоним) EC 3.4.24.- , а не EC 3.4.24.10, например? Ведь
имя EC 3.4.24.- описывает до 86 белков (такой был старший номер в списке,
но некоторые записи были удалены, так что их меньше, чем 86). Кстати, белка
Putative metalloprotease ybeY в этом списке вообще нет, что окончательно
ставит в тупик. Словом, ясно одно: ЕС - значит фермент, а цифры - его
класс.

После того, как основное задание выполнено, можно поискать гены с названием
ybe в менее специализированных источниках. Я обратились к энциклопедии
E.coli (www.ecocyc.org), которая содержит информацию о белках и НК не
только кишечной палочки. Поисковик по запросу «ybe» нашел не только
множество белков, но и целое семейство генов:
ybeA
ybeB
ybeD
ybeF
ybeH
ybeL
ybeM
ybeQ
ybeR
ybeT
ybeU
ybeX
ybeY
ybeZ
citC (ybeO)
crcB (ybeI)
djlB (ybeS)
djlC (ybeV)
dpiB (ybeP)
gltI (ybeJ)
hybE - ну, этот не считается
hscC (ybeW)
nadD (ybeN)
pagP (ybeG)
rihA (ybeK)
tatE (ybeC)
Я рассмотрела многие гены, накопала множество ссылок на самые разные
ресурсы, но из адекватных сведений обнаружила только то, что гены X, Y и Z
находятся рядом (идут подряд) и видимо, принадлежат одному оперону. В
целом, происхождение и смысл этой группы генов остался для меня непонятным.
Еще одна проблема возникла при попытке поискать белок с похожим
лигандом. Из первого семестра известно, что лиганды моего белка - ионы
никеля, по одному на цепь. А вот в полученом описании указываются ионы
цинка. Вот, посмотрите сами:
[pic]
Это в документе из банка UniProt, а в PDB-файле:
[pic]
И кто из них прав?
|На рисунке: Ион никеля |
|изображен в виде синего шара, |
|примерное расположение |
|предполагаемого четвертого |
|координационного сайта для |
|этого иона показано звездочкой |
|(первые три - атомы азота в |
|остатках гистидтна) |


С одной стороны, ионы цинка встречаются как лиганды во многих белках, и
вообще, содержание цинка в живых клетках вполне ощутимо. Никель - более
экзотический лиганд, и поскольку он блокирует связи для других лигандов,
занимая их место, он может быть ядовит (блокирует некоторые белки). Это
его свойство может быть использовано в кристаллографии белка. Можно было бы
предположить, что ион цинка в белке искусственно заменили на ион никеля,
но! Мне удалось найти полную версию статьи о моем белке, в которой
говорится о том, что по результатам рентгенографической кристаллографии
авторы предположили, что лигандом является ион никеля. (X-ray fluorescence
analysis of the purified protein suggests that the metal is a nickel ion.)
полная версия статьи нашлась на сайте http://www.pubmedcentral.nih.gov/ -
открытый архив статей, ссылка на статью -
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1978141.

Таким образом, вопрос о металле этого белка остается открытым

Дополнительные задания
1)Сравним два белка:

| |Метка |Содержание | |
| |поля | | |
|Код (ы) доступа |AC |P0A898; P77385 |P0A899; P77385; |
|("Accession | | | |
|number") | | | |
|Идентификатор |ID |YBEY_ECOLI - (название белка) |YBEY_SHIFL |
|записи в БД | |Reviewed; |Reviewed; 155 |
| | |155 AA (его длина) |AA. |
|Название |DE |Putative metalloprotease ybeY |Putative metalloprotease|
|(краткое | |(EC 3.4.24.-) |ybeY (EC 3.4.24.-) |
|описание) белка | | | |
| | | | |
|Дата создания |DT |26 апреля 2005 |26-APR-2005 |
|документа | |года(26-APR-2005) | |
|Дата последнего |DT |05-FEB-2008 |05-FEB-2008 |
|исправления | | | |
|аннотации | | | |
|Число |RN |5 |2 |
|публикаций, | | | |
|использованных | | | |
|при создании | | | |
|документа | | | |
|Журнал и год |RL |Acta Crystallogr. F |Infect. Immun. |
|самой поздней | |61:959-963(2005) |71:2775-2786(2003) |
|публикации | | | |
|Ключевые слова |KW |3D-structure; Complete |Complete proteome; |
| | |proteome; Hydrolase; |Hydrolase; |
| | |Metal-binding; |Metal-binding; |
| | |Metalloprotease; Protease; |Metalloprotease; |
| | |Zinc. |Protease; Zinc. |
|Что содержит |CC |FUNCTION |FUNCTION |
|поле | |COFACTOR |COFACTOR |
|комментариев | |INTERACTION |SIMILARITY |
| | |SIMILARITY | |
|Идентификаторы |DR |1XM5 |нет |
|записей PDB | | | |

2)к сожалению, аминокислотные последовательности этих белков абсолютно
идентичны, кроме того, строка
PE 3: Inferred from homology;
в описании белка шигеллы говорит о том, что существование белка было
предположено исходя из того, что такой белок есть у E. Coli. Так что,
строго говоря это один и тот же белок. А небольшие различия в описаниях
(выделены желтым) указывают на то, что белок кишечной палочки был
исследован раньше, хотя в базу данных UniProt они попали в один день.
Для более яркого примера возьмем белок эукариотного организма:
| |Метка |Содержание | |
| |поля | | |
|Код (ы) доступа |AC |P0A898; P77385 |Q8MUS5; |
|("Accession | | | |
|number") | | | |
|Идентификатор |ID |YBEY_ECOLI - (название |Q8MUS5_MASBA |
|записи в БД | |белка) Reviewed;|Unreviewed; 139 AA |
| | | | |
| | |155 AA (его длина) | |
|Название |DE |Putative metalloprotease |Putative zinc |
|(краткое | |ybeY (EC 3.4.24.-) |metalloprotease (Fragment)|
|описание) белка | | | |
| | | | |
|Дата создания |DT |26 апреля 2005 |01-OCT-2002 |
|документа | |года(26-APR-2005) | |
|Дата последнего |DT |05-FEB-2008 |24-JUL-2007 |
|исправления | | | |
|аннотации | | | |
|Название |OS |Escherichia coli (strain |Mastigamoeba balamuthi |
|организма | |K12) |(Phreatamoeba balamuthi) |
|Классификация |OC |Bacteria; Proteobacteria; |Eukaryota; Pelobiontida; |
|организма | |Gammaproteobacteria; |Mastigamoebidae; |
|(список | |Enterobacteriales; |Mastigamoeba. |
|таксонов) | |Enterobacteriaceae; | |
| | |Escherichia. | |
| Длина |ID, SQ|155 AA |139 AA |
|последовательнос| | | |
|ти | | | |
|Молекулярная |SQ |17526 MW |15324 MW |
|масса белка | | | |
|Описание |FT |Указано наличие ионов цинка,|Строки |
|вторичной | |какие аминокислоты (по |FT NON_TER 1 |
|структуры | |номерам) образуют те или |1 |
|Укажите, есть ли| |иные элементы вторичной |FT NON_TER 139 |
|такое описание, | |структуры |139 |
|и в чем оно | | |Указывают на то, что |
|состоит. | | |конечный остаток не |
| | | |является терминальным. |
| | | |Других данных нет |
|Особенности | |FT HELIX 33 36 |PE 4: Predicted |
|последовательнос| |FT STRAND 37 46 |Этот белок был предсказан |
|ти | |FT HELIX 48 59 |без основы в виде |
|Не копируйте, а | |Одиночный strand - |последовательности НК или |
|перечислите, | |остальные листы - парами, а |похожих белков у |
|какие | |этот один |родственных групп |
|особенности | | |организмов |
|отражены в | | | |
|документе! | | | |
|Число |RN |5 |1 |
|публикаций, | | | |
|использованных | | | |
|при создании | | | |
|документа | | | |
|Журнал и год |RL |Acta Crystallogr. F |Submitted (MAY-2002) to |
|самой поздней | |61:959-963(2005) |the EMBL/GenBank/DDBJ |
|публикации | | |databases. |
|Ключевые слова |KW |3D-structure; Complete |Metalloprotease; Protease.|
| | |proteome; Hydrolase; | |
| | |Metal-binding; | |
| | |Metalloprotease; Protease; | |
| | |Zinc. | |
|Что содержит |CC |FUNCTION |Указание на копирайт и |
|поле | |COFACTOR |лицензию. |
|комментариев | |INTERACTION | |
| | |SIMILARITY | |
|Идентификаторы |DR |1XM5 |нет |
|записей PDB | | | |


Это пример оказывается тоже не самым удачным, поскольку нет сведений о его
вторичной структуре, да и вообще о нем ничего конкретного не скажешь - он
ведь предсказанный, да еще и фрагмент. Во всяком случае, у эукариот тоже
есть металлопротеазы с цинком.
Одним словом, белок ybeY_ecoli встречается у многих близких к
кишечной палочке бактерий, но поскольку он все-таки спрогнозированный, и
многие схожие с ним по функциям белки также предсказаны, то трудно найти
его аналог, выполняющий те же функции в другом организме.


3) С помощью putty получим записи следующих белков:
entret sw: P0AE78 -auto
corC_ECOLI , синоним - ybeX

wget http://www.expasy.ch/uniprot/P0A9K3.txt
PHOL_ECOLI, кодируется геном ybeZ

Полученные файлы помещены в директорию practice1